[發(fā)明專利]高親和力抗體

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 99810367.5
• 申請日: 1999-08-20
• 公開（公告）號: CN1315966A
• 公開（公告）日: 2001-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: P·J·哈里森
• 申請（專利權(quán)）人: KS生物醫(yī)學(xué)有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K16/30;C12N15/13;C12N15/63
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 樊衛(wèi)民

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗體及其治療用途。

發(fā)明背景

抗體曾經(jīng)長期被認(rèn)為是治療癌癥和其它疾病潛在的有力工具。然而，盡管存在一些明顯的例外，這種潛力尚未獲得普遍的認(rèn)識。

這種成功的相對缺乏可能至少在某種程度上是由于使用了來源于嚙齒類的單克隆抗體，該抗體很少具有高于10^-9M的親和力。具有這種親和力水平的抗體治療效用有限，因為已證明很難將足夠的抗體運送至靶標(biāo)以實現(xiàn)有用的生物學(xué)活性。抗體與抗原結(jié)合是可以逆轉(zhuǎn)的，并且在體內(nèi)實際使用的抗體濃度下，更傾向于解離而不是結(jié)合。原則上，有可能通過增加抗體濃度來抵消抗原的解離。然而，這可能會引起無法接受的臨床副作用并且也將增加治療相關(guān)的費用。

發(fā)明概述

本發(fā)明基于如下認(rèn)識：可生產(chǎn)“酸耐受性”抗體或其片段，并且這種酸耐受性與抗體和抗原的高親和力結(jié)合有關(guān)。

根據(jù)本發(fā)明，一種高親和力抗體具有如下特征的親和力：

(ⅰ)在抗原包被的微量滴定板的孔內(nèi)溫育第一種和第二種抗體樣品，其濃度選擇在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性反應(yīng)部分之中，pH7.2,37℃,1小時；

(ⅱ)從兩種樣品中去除未結(jié)合的抗體；

(ⅲ)將第一種樣品與PBS在pH7.2,37℃條件下溫育1小時，并將第二種樣品的pH值降至pH3或更低后37℃溫育1小時；

(ⅳ)去除兩種樣品中未結(jié)合的抗體；

(ⅴ)將兩種樣品與抗抗體堿性磷酸酶偶聯(lián)物在37℃溫育1小時；

(ⅵ)去除兩種樣品中未結(jié)合的偶聯(lián)物；以及

(ⅶ)向樣品中加入PNPP底物，測定樣品在405nm的光吸收值，以確定與抗原結(jié)合的抗體量，其中第二種樣品的結(jié)合量大于50％的第一種樣品的結(jié)合量。

優(yōu)選地，步驟(ⅲ)中最大pH值為2.5，更優(yōu)選為2.0。

預(yù)計具有酸耐受性的抗體或抗體片段更有利于結(jié)合而非解離，因而它們在靶位點具有更長的定居時間，導(dǎo)致更高的定居于靶位點的抗體濃度。

特別地，本發(fā)明涉及一種高親和力單鏈Fv抗體片段的生產(chǎn)。這種ScFv具有特別的優(yōu)點，它可允許其在體內(nèi)更好地靶定位點。

附圖描述

圖1表明了在多種pH值下具有對癌胚抗原親和力的綿羊和小鼠單克隆抗體以及單鏈Fv的酸耐受性結(jié)果。

發(fā)明描述

可以使用多種技術(shù)獲得根據(jù)本發(fā)明的酸耐受性單克隆抗體。例如，可以使用經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)，包括分泌高親和力抗體的免疫動物的B淋巴細(xì)胞與另一種適宜的融合伴侶的融合。另外一種可選擇的方法為純化所挑選的淋巴細(xì)胞的mRNA，并使用PCR技術(shù)擴增所需要的抗體基因。噬茵體展示技術(shù)和其它用于抗體片段展示的技術(shù)也可以用來在適當(dāng)?shù)暮Y選過程之后從原始文庫或免疫文庫中獲得抗體基因。

抗體基因可以同毒素、放射性同位素、酶或其它任何合乎需要的分子共表達(dá)或化學(xué)交聯(lián)，以提供具有強結(jié)合特點的融合蛋白。進(jìn)一步，抗體可通過US-A-5770429所述的方法由轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行生產(chǎn)。

抗體可以是包括重鏈和輕鏈以及恒定區(qū)和可變區(qū)的完整抗體。另外可選擇地，抗體可以是抗體片段，例如F(ab′)₂、Fab、Fv或單鏈Fv片段，只要包含了賦予“酸耐受性”的可變區(qū)的至少一部分。抗體也可以是動物抗體、嵌合抗體或人源化抗體。專利WO-A-92/15699中公開了一種生產(chǎn)人源化抗體的適當(dāng)方法。

在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，抗體為單鏈Fv片段。單鏈Fv片段包含由一適宜的肽連接的重鏈和輕鏈的可變區(qū)。

本發(fā)明的抗體可以由其酸耐受性定義，其可由如上所述的酸洗的酶聯(lián)免疫吸附實驗(EIA)表征。一般，與pH7.2條件下樣品由EIA獲得的A₄₀₅值相比較，pH3或更低pH值條件下樣品的A₄₀₅值將代表＞50％的抗體結(jié)合。優(yōu)選地，樣品在pH2條件下的A₄₀₅值將代表＞60％，更優(yōu)選地為70％的pH7.2條件下獲得的抗體結(jié)合。

經(jīng)受免疫接種的動物不是嚙齒類，而是選擇可產(chǎn)生更高親和力抗體的動物?？梢允褂萌魏未笮筒溉轭悇游铮疫m宜的動物包括兔子、山羊、母牛和綿羊。

本發(fā)明的抗體可用于治療，并且可以與生理可接受的賦形劑、稀釋劑或載體一起配制入任何適當(dāng)?shù)慕M合物。

以下實施例闡明了本發(fā)明。

實施例1

用完全福氏佐劑中的癌胚抗原(CEA)免疫綿羊，然后用不完全福氏佐劑中的抗原加強免疫三次。在末次加強免疫之后處死動物并取出淋巴結(jié)。