[發(fā)明專利]以綠熒光蛋白(GFP)為標(biāo)記的腫瘤轉(zhuǎn)移模型

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 98804513.3
• 申請(qǐng)日: 1998-04-28
• 公開（公告）號(hào): CN1264429A
• 公開（公告）日: 2000-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚玉英;千島隆司
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 抗癌股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/86
• 分類號(hào): C12N15/86;C12N5/10;A01K67/027;C07K14/435
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 陳文青

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腫瘤發(fā)展的研究。具體地說，涉及用于研究脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中腫瘤轉(zhuǎn)移的模型系統(tǒng)。

背景技術(shù)

一直以為，腫瘤組織的轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤威脅生命的主要原因。轉(zhuǎn)移即在不同于原發(fā)腫瘤的部位長(zhǎng)出了繼發(fā)腫瘤。這樣，雖然手術(shù)去除了原發(fā)腫瘤，但卻不能阻止病情的發(fā)展。理解轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制對(duì)于開發(fā)出控制繼發(fā)腫瘤生長(zhǎng)的方法是至關(guān)重要的。為了理解轉(zhuǎn)移機(jī)制，需要提供一種模型，它能夠在大量的宿主細(xì)胞背景下鑒定出少量的腫瘤細(xì)胞，從而在實(shí)際病程發(fā)展中發(fā)現(xiàn)繼發(fā)腫瘤栓和微轉(zhuǎn)移。

已經(jīng)有人用外部熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞在體外證實(shí)了腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的外滲和最初的播種步驟。Khokha，R等，Cancer?Metastasis?Rev(1995)14：279-301；Koop，S.等，Cancer?Rev(1995)55：2520-2523。而且，Margolis，L.B.等，In?VitroCell?Dev?Biol.(1995)31：221-226顯示外部熒光標(biāo)記的肺腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)的宿主小鼠肺中的遷移。然而，在所有情況下由于外源熒光標(biāo)記的限制而不能作長(zhǎng)時(shí)間的觀察。已知，用逆轉(zhuǎn)錄病毒來轉(zhuǎn)移綠熒光蛋白基因(GFP)能在體外產(chǎn)生人癌癥細(xì)胞(Levy，J.P.等，Nature?Biotechnol(1996)14：610-614)和造血細(xì)胞(Grignani，F(xiàn).等，Cancer?Res(1998)58：14-19?&?Cheng，L.等，Gene?Therapy(1997)4：1013-1022)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。

曾經(jīng)嘗試提供以β-半乳糖苷酶基因?yàn)闃?biāo)記的模型(Lin，W.C.等，CancerRes.(1990)50：2808-2817；Lin，W.C.等，Invasion?and?Metastasis(1992)12：197-209)。但是，這一標(biāo)記被證實(shí)不理想，因?yàn)椴荒苁褂眯迈r或處理過的組織。本發(fā)明提供了一種標(biāo)記，它能夠顯示活的新鮮組織中腫瘤的的入侵和微轉(zhuǎn)移。而且，采用合適的對(duì)比介質(zhì)，本發(fā)明方法可用于顯示已形成和正在生長(zhǎng)的腫瘤中的血管生成。本發(fā)明方法不僅可以用來作為腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的模型，而且利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還可以用于獲得腫瘤患者體內(nèi)的臨床信息。

本發(fā)明用綠熒光蛋白(GFP)作為標(biāo)記。美國(guó)專利5,491,084揭示了該蛋白的異源表達(dá)，主要用于監(jiān)測(cè)融合DNA的表達(dá)。該專利說明了GFP在大腸桿菌和C.elegans中的表達(dá)，還假設(shè)一般細(xì)胞都可以經(jīng)修飾來表達(dá)GFP。根據(jù)該專利，這樣的表達(dá)不僅是監(jiān)測(cè)融合DNA表達(dá)的方法，而且還是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的方法。

本發(fā)明提供轉(zhuǎn)移模型方面的內(nèi)容已在許多出版物中報(bào)道和描述過。Chrishima，T.等，Cancer?Research(1997)57：2042-2047說明的是構(gòu)建含有人源化綠熒光蛋白(GFP)基因和二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的二順反子載體。該載體轉(zhuǎn)染入CHO-K1細(xì)胞而得到克隆-38。克隆-38表現(xiàn)出穩(wěn)定的GFP表達(dá)，在氨甲蝶呤(MTX)存在下維持。克隆-38細(xì)胞注射給小鼠獲取腫瘤片段，然后通過外科正位移植(OSI)將片段移植到裸鼠的卵巢絨毛膜上。可以在該模型中跟蹤轉(zhuǎn)移。

Chishima，T.等Proc?Natl?Acad?Sci?USA(1997)94：11573-11576說明的是用來自Clontech的hGFP-S65T克隆的優(yōu)化密碼子轉(zhuǎn)染Anip?973人肺腺癌制備克隆-26。克隆-26靜脈注射給裸鼠，然后在組織培養(yǎng)物中跟蹤生成的腫瘤。

Chishima，T.等Clin.Exp.Metastasis(1997)15：547-552和Chishima，T.等Anticancer?Res(1997)17：2377-2384說明了用克隆-26進(jìn)行的類似的工作，其中，所述細(xì)胞被皮下接種給裸鼠，導(dǎo)致生成腫瘤，然后將所得的腫瘤通過SOI移植到裸鼠的胸膜臟層。還在該模型中觀察到了腫瘤轉(zhuǎn)移。

Chishima，T.等In?Vitro?Cell?Dev?Biol.(1997)33：745-747說明的是克隆-26的組織培養(yǎng)和利用GFP發(fā)出的熒光顯示其生長(zhǎng)。

以上出版物均在此納為參考。

此外，Chen，L.等，Gene?Therapy(1997)4：1013-1022說明的是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子調(diào)控下的GFP基因來修飾造血干細(xì)胞。雖然，作者稱用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染人的干細(xì)胞只是有些困難，但是采用GFP的加強(qiáng)形式，可以獲得令人滿意的亮度。