[發明專利]用于基因治療的含雜交啟動子的核酸構建體

無效

• 申請號: 97119658.3
• 申請日: 1997-09-23
• 公開（公告）號: CN1179470A
• 公開（公告）日: 1998-04-22
• 發明（設計）人: K－H·塞法特;R·穆勒;H－H·斯德拉斯克
• 申請（專利權）人: 赫徹斯特股份公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N5/10;C07H21/00;A61K48/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 李瑛

本申請涉及可以用于基因操作，特別是用于疾病預防或治療(下文稱為基因治療)的核酸構建體。在基因治療中，有待在有機體中表達的基因被引入到有機體中。這些基因表達的調節對基因治療的預防和治療效果有重要意義。

專利申請PCT/GB95/02000、PCT/EP95/03370、PCT/EP95/03371、PCT/EP95/03368和PCT/EP95/03339描述了基因表達的調節物。這些調節物包括激活物序列，其功能是，例如，細胞特異性或病毒特異性地激活基礎轉錄。此激活物序列的DNA序列通過其3′末端和啟動子組件的5′末端連接。接著結構基因通過其5′末端和此啟動子組件的3′末端連接。

啟動子組件由結合CDF和CHF家族或E2F和CHF家族之轉錄因子的核酸序列組成。在細胞周期的G0和G1期，這種結合導致上游激活物序列的抑制，結果使位于下游(即在轉錄方向上)的結構基因抑制或者轉錄。

在細胞分裂的G0和G1期，細胞含有的DNA以二倍體狀態存在。在G0期，細胞處于靜止狀態，而在G1期，其細胞周期進程受到抑制。G1期之后是S期，此期發生DNA合成并且基因組復制。然后是G2期，此期細胞處于四倍體狀態。G2期之后是細胞分裂期(有絲分裂＝M期)。然后子代細胞進入G0狀態和G1狀態。

在G0和G1期，細胞特異性或者病毒特異性的激活物序列和抑制激活物序列的啟動子組件組合使以細胞特異性或者病毒特異性以及細胞周期特異性(即局限于S和G2期)的方式調節結構基因的表達成為可能。

激活物序列和啟動子組件的組合體被稱為嵌合啟動子。嵌合啟動子在基因治療上有很多可能的應用，但由子其缺點也有很多限制：

這些限制的例子是：

—引起結構基因極低水平轉錄的弱激活物序列，

—在完全依靠細胞周期的方式中，不能被選擇的啟動子組件抑制的激活物序列的使用，

—對兩種結構基因轉錄調節物(例如細胞特異性或病毒特異性和細胞周期特異性)的限制，

—已經導入細胞中的結構基因之轉錄產物的不充分胞內運輸。

本發明通過提供本發明的核酸構建體，克服了利用已知嵌合啟動子表達外源基因的這些弱點，這些核酸構建體使得可以在宿主細胞中調節外源基因的表達。

本發明的目的是使得可以獲得能夠在宿主細胞中以精確的方式調節外源基因(轉基因)表達的核酸構建體。因此，本發明涉及核酸構建體，其中通過至少一種顯示出第一突變(這種突變抑制轉基因的正常表達)的核酸序列來完成轉基因的精確調節，另外，其中至少另一種核酸序列顯示出第二突變，這種突變消除(abolish)第一核酸序列(S)中由于突變而產生的抑制作用。

具體地說，本發明的核酸構建體通過利用可變(alternative)構建體調節宿主細胞中的轉基因表達。當含有第一突變的核酸序列是轉基因(b)(這種轉基因包含抑制所說的轉基因轉錄和/或翻譯或者抑制藥理活性化合物功能的突變)時，這種核酸構建體還包含定位于轉基因5′末端的第一啟動子或增強子序列(a)；或者，當含有第一突變的核酸序列是第一啟動子或增強子序列(a′)(其包含抑制第一啟動子功能的突變)時，核酸構建體還包含編碼藥理活性化合物的轉基因(b′)。另外，至少一種包含第二突變的核酸序列消除由于第一突變而引起的抑制作用。

這些核苷酸序列在相同或不同啟動子序列控制之下，因此轉基因只有在所有啟動子序列都被激活的情況下才能表達。

優選的是，新核酸構建體在5′末端至3′末端方向的閱讀框架中，包含至少下列組件：

第一(I)啟動子或者增強子序列(a)，其是非特異性的、細胞特異性或病毒特異性的，或者其可以被四環素或代謝性地和/或細胞周期特異性地激活，其激活轉基因的轉錄并且包含抑制此啟動子功能的突變(a′)，

作為結構基因的轉基因(b′)，這種轉基因編碼活性化合物并且可能包含終止結構基因轉錄和/或翻譯或者抑制結構基因產物功能的突變，

第二(II)啟動子或者增強子序列(C)或(C′)，這種序列是非特異性的、細胞特異性或者病毒特異性的，或者其可以被代謝性地和/或細胞周期特異性地激活，其激活組件(d)或(d′)的基礎轉錄并且包含抑制此啟動子功能的突變，

用于消除(relieve)一種或多種啟動子或者轉基因中的突變的tRNA(抑制基因tRNA)或者調節蛋白質(d)或者(d′)的基因。