[發明專利]表達膽汁鹽刺激脂酶(BSSL)的DNA分子

無效

• 申請號: 96194083.2
• 申請日: 1996-03-12
• 公開（公告）號: CN1185812A
• 公開（公告）日: 1998-06-24
• 發明（設計）人: G·達斯
• 申請（專利權）人: 阿斯特拉公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N9/20;C12N1/19
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 盧新華,譚明勝

技術領域

本發明涉及用于在甲基營養酶母巴斯德畢赤酵母中表達膽汁鹽刺激脂酶(BSSL)的方法中的DNA分子，重組載體和細胞培養物。背景技術

膽汁鹽刺激脂酶(BSSL；EC3.1.1.1)(綜述見Wang和Hartsuck，1993)提供大部分人乳汁脂裂解活性。該脂酶的一個特點是需要初級膽汁鹽來提供抗乳化的長鏈三?；视偷幕钚?。至今為止，僅在來自人，大猩猩，貓和狗的奶中發現了BSSL(Hernell等，1989)。

BSSL在母乳喂養嬰兒的腸中的乳汁脂肪的消化中起著關鍵性的作用(Fredrikzon等，1978)。BSSL在人分泌乳汁的乳腺中合成并隨乳汁一起分泌(Bickberg等，1987)。它占全部乳汁蛋白的約1％(Blckberg和Hernell，1981)。

已認為BSSL是脂肪吸收和隨后的生長中主要速率限制因素，尤其是未成年的在其自身合成BSSL有缺陷的嬰兒。補充純化酶的辦法明顯改善了這些嬰兒的消化和生長(U.S.4,944,944；Oklahoma醫學研究基金)。這在制備含有高百分比的三甘油酯和基于植物或非人類乳汁蛋白來源的嬰兒配制劑的生產中具有臨床學重要性，因為用這些配制劑喂養的嬰兒在沒有外加的BSSL時不能消化脂肪。

已鑒定出乳汁BSSL和胰羧酸酯水解酶(CEH)的cDNA結構??(Baba等，1991；Hui和Kissel，1991；Nilsson等，1991，Reue等，1991)，并已作出結論，即乳汁酶和胰酶為相同基因，CEL基因的產物。CEL基因的cDNA序列(SEQ?ID?NO：1)公開在US5,200,183(Oklahoma醫學研究基金)；WO?91/18293(Aktiebolaget?Astra)；Nilsson等(1990)；和Baba等(1991)中。推測的BSSL蛋白的氨基酸序列，包括23個氨基酸的信號肽，示于序列表中的SEQ?ID?NO：2，同時722個氨基酸的天然蛋白質的序列示于SEQ?ID?NO：3。

蛋白質的C末端區含有各為11個氨基酸殘基的16個重復單元，接著是11個氨基酸的保守區段。天然蛋白質為高度糖基化，并已報道了寬范圍的觀察到的分子量。這可通過糖基化的變化程度來解釋(Abouakil等，1988)。該的N末端的一半與乙酰膽堿酯酶和一些其它的酯酶同源(Nilsson等，1990)。

可通過在適宜宿主，例如大腸桿菌，啤酒糖酵母或哺乳動物細胞系中的表達來制備重組BSSL。為了擴大這種制備費用為商業上可接受的BSSL表達體系，可設想使用異源表達體系。如上面所提到的，人BSSL在C末端具有11個氨基酸的16個重復單元。為了確定這一重復區域的生物重要性，已構建了部分缺少或全部缺少重復區的人BSSL各種突變體(Hansson等，1993)。變異體BSSL-C(SEQ?ID?NO：4)，例如缺失氨基酸殘基536-568以及殘基591-711。使用哺乳動物細胞至C127宿主和牛乳頭狀瘤病毒表達載體的表達研究表明各種變異體可以活性形式表達(Hansson等，1993)。從表達研究中還可總結出人BSSL中的富含脯氨酸的重復對于BSSL的催化活性或膽汁鹽活性是非必需的。然而，在哺乳動物表達體系中制備BSSL或其突變體對于常規治療用途來說可能太昂貴。

與使用原核體系相比，真核體系，例如酵母對于制備由重組DNA編碼的一些多肽可提供明顯的優點。例如，酵母可通常比細菌生長的細胞密度高，并可證實能糖基化表達的多肽，而這種糖基化對于生物活性是重要的。然而，使用啤酒糖酵母作為宿主器官通常導致不良的表達水平和重組蛋白的不良分泌(Cregg等，1987)。啤酒糖酵母中的異源蛋白質的最高水平為占全部細胞蛋白質5％的范圍(Kingsman等，1985)。使用啤酒糖酵母作為宿主的另一個缺點是重組蛋白質可能被過度糖基化，這樣可能影響糖基化的哺乳動物蛋白質的活性。

巴斯德畢赤酵母是以甲醇作為唯一碳源和能源而生長的甲基營養酵母，因為它包含高度調控的甲醇利用途徑(Ellis等，1985)。畢赤酵母還可適合于有效的高細胞密度發酵技術。因此，重組DNA技術和有效的酵母轉化的方法使得有可能開發巴斯德畢赤酵母作為使用基于甲醇氧化酶啟動子的表達體系高產量地表達異源蛋白質的宿主(Cregg等，1987)。