[發明專利]一種在基因治療載體制劑中測定功能失活基因之數量的快速檢驗方法

無效

• 申請號: 96192612.0
• 申請日: 1996-02-14
• 公開（公告）號: CN1178557A
• 公開（公告）日: 1998-04-08
• 發明（設計）人: J·羅斯;張維維;B·托奎;L·布哈克
• 申請（專利權）人: 德克薩斯州立大學董事會;羅納－布朗克羅萊爾股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 李瑛

?????????????????發明所屬技術領域

本發明總的來說涉及用于基因治療中的重組體的質量控制領域。具體地說，本發明涉及一種測定方法，其能用來估價編碼治療基因之載體貯存物中缺損載體的百分比。更具體地說，本發明涉及一種方法，其用于在腺病毒貯存物中估價包含非功能性p53基因之腺病毒的百分比，所述貯存物包含用于臨床基因治療的野生型p53。

?????????????????????相關技術描述

已知目前治療癌癥的方法(包括放射治療、外科治療和化療)的療效是有限的。例如，在美國每年死于肺癌的人數超過140,000人。前不久，各種年齡的肺癌死亡率在婦女中超過乳腺癌。雖然執行減少吸煙計劃以降低吸煙的流行，但在21世紀肺癌死亡率將仍然很高。合理的開發新的肺癌療法將取決于在分子水平上對肺癌的生物學理解。

已知很多癌癥至少在部分上是由于基因的反常造成的，這些反常導致已知或更多基因的過量表達，或者是反常、突變基因或者是基因組的表達。例如，在許多情況之下，已知致癌基因的表達會導致癌癥的產生。“致癌基因”是改變了的基因，其突變的表達產物以某種方式破壞細胞功能或細胞調節(Spandidost等，1989)。

人們發現，到目前為止所研究的許多致癌基因是作為突變的結果被“激活的”，通常，認為在一個正常的細胞基因的編碼區中的一個點突變是“原致癌基因”。在所表達的蛋白質產物中，這些突變導致氨基酸的取代。這種改變了的表達產物表現出一種異常生物學功能，其有助于產生致癌過程(Travali等，1990)。能利用各種方法產生潛在的突變，如化學誘變或者是電離輻射。已經鑒別出了某些致癌基因和致癌基因家族，其中包括ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun和abl，并且在一定程度上對其進行了定性(Travali等，1990；Bishop，1987)。

在正常細胞生長的過程中，人們認為某些促進生長的原致癌基因是通過生長限制腫瘤抑制基因來反平衡的。某些因素可能在這兩種力量中對失調具有作用，導致致瘤性狀態。在腫瘤抑制基因中這樣的因子就是突變(Weinberg，1991)。

一個重要的腫瘤抑制子是細胞蛋白質p53，這是一個53kD的核磷蛋白，其能控制細胞增殖。在人類噁性腫瘤中，人們鑒別了在染色體17p的p53基因和等位基因缺失中的點突變(p53基因被定位的地方)，其處于最頻繁的改變中。p53蛋白質在整個進化過程中高度保守并且在大多數正常的組織中表達。野生型p53顯示出了和細胞周期控制(Mercer，1992)、轉錄調節(Field等，1991)編程性細胞死亡的誘導相關(Yonish-Rouach等，1991，和Shaw等，1992)。

已知各種突變體的p53等位基因，其中單一堿基替換導致蛋白質的合成的改變，因而改變了生長調節劑的性質，最終導致惡性腫瘤(Hollstein等，1991)。事實上，發現p53基因在普通的人類癌癥中是突變率最快的基因(Hollstein等，1991；Weinberg，1991)，并且尤其和吸煙有關的癌癥相聯系(Hollstein等，1991；Zakut-Houri等，1985)。已經證明了在乳房腫瘤中突變的p53過量表達(Casey等，1991)。

癌癥的基因治療最有意義的方面涉及到腫瘤抑制基因(如p53)的利用。已經有過報導，野生型p53轉染到一定類型的乳房和肺癌細胞中能在細胞系上恢復生長抑制控制(Casey等，1992)。雖然直接轉染DNA不是一種把DNA引入患者細胞有效的方法，但是這些結果能表明：如果改進的轉移腫瘤抑制基因的方法進一步發展，對癌癥進行腫瘤抑制可以是一種有效的治療方法。

目前已經研究和發展了能夠用于基因治療的腫瘤抑制和腫瘤消除基因的轉移系統。由于病毒在感染實際的生活細胞非常有效并且有一種能把病毒本身的遺傳物質轉移到靶細胞的方法，因此以病毒為基礎的基因轉移運載工具具有特殊的興趣。例如，在產生一種逆轉錄病毒工程載體來轉移各種基因這一點上，取得了某些進步。最近在某些基因轉移方案中，在體外和在動物研究中已經成功地得到腺病毒載體系統。

由于改進了基因治療癌癥的方法和組合物，因此臨床治療變得可能了。這將需要生產大規模的載體貯存物。這樣的大規模生產包括從任意指定的具有100％活性的“最早的”載體貯存物庫中產生大量的樣品載體貯存物。這種在“規模上”考慮引起活性的過度損失。很明顯，在采取任何治療之前，樣品載體貯存物的質量控制分析將是一個必要的步驟。例如，必須保證樣品載體貯存物包含足夠的活性載體以調節預期的治療效果。