[發(fā)明專利]重組人糖基化尿激酶原的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 96119836.2
• 申請日: 1996-09-27
• 公開（公告）號: CN1062016C
• 公開（公告）日: 2001-02-14
• 發(fā)明（設計）人: 方繼明;肖成祖;余煒源;張正光;李風知;黃子才;陳昭烈;葉建新
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12N15/58
• 分類號: C12N15/58;C12N15/85;C12N15/06
• 代理公司: 中國人民解放軍總后勤部專利服務中心
• 代理人: 吳嘉善

1．一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，包括以下步驟：(1)人尿激酶原全長cDNA基因的構建和克隆，(2)表達載體的構建，(3)CHO工程細胞的轉染和篩選，(4)CHO工程細胞的培養(yǎng)和(5)CHO工程細胞分泌產(chǎn)物的純化，其特征在于CHO工程細胞是以CHO?dhfr^-為宿主細胞，所述的表達載體是pMTSV-du，它由下圖所示的各元件組成，并用微載體灌流培養(yǎng)技術高密度培養(yǎng)和放大培養(yǎng)CHO工程細胞。?????

2．如權利要求1所述的一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于：

(1)人尿激酶原全長cDNA基因的克隆，是采用肉豆寇酯誘導Detroit?562細胞，使細胞中尿激酶mRNA的含量提高8倍以上，用酸性硫氰胍-酚-氯仿法提取細胞總RNA，oligo(dT)-纖維素柱層析法分離poly(A⁺)RNA，通過反轉錄和dG·dC接尾重組技術構建成Detroit?562細胞的cDNA文庫，通過篩選而獲得含有編碼尿激酶基因片段的陽性克隆株，采用人工合成寡核苷酸片段和DNA重組技術，構建尿激酶原全長cDNA基因并克隆至pUC19質粒DNA，獲得一個pMM-UK重組質粒，經(jīng)全序列測定證明，cDNA核苷酸序列全長為1565bp，包括編碼20個氨基酸信號肽的60bp序列，編碼411氨基酸尿激酶原的1233bp序列和272bp3'非編碼序列，該基因5'端含有HindⅢ和EcoR?1單一酶切位點，3'端含有SdlⅠ，XbaⅠ，SmaⅠ，KpnⅠ和SacⅠ?5個單一酶切位點，便于尿激酶原的克隆和表達；

(2)中間載體pSV₂-pro-UK的構建，是將pSV2-dhfr載體用Bgl?Ⅱ酶切后用Klenow?F酶末端補平，再用HindⅢ酶切，分離回收載體大片段，從pMM-UK質粒DNA中，用HindⅢ和SmaⅠ雙酶切，分離pro-UK?cDNA，再將載體大片段與pro-UK?cDNA連接形成可表達pro-UK的重組質粒pSV2-pro-UK；

(3)中間載體pMTSV-dhfr的構建，是將pSV2-dhfr表達質粒用BglⅡ酶切，并用Klenow?F酶將末端補平，再通過T4?DNA連接酶將質粒重新環(huán)化，并消除質粒中的BglⅡ酶切位點，然后將該質粒經(jīng)BamH?1和pVUⅡ雙酶切及KlenowF酶將末端補平，通過電泳回收1.9Kb?DNA片段，它含SV40增強子和二氫葉酸還原酶基因，將此片段插入經(jīng)EcoR1酶切，klenowF酶末端補平的pXMT載體中，從而獲得了長度為8.25Kb的中間載體pMTSV-dhfr；

(4)表達載體pMTSV-du的構建，將pSV2-pro-UK重組質粒經(jīng)SalⅠ酶切，Klenow?F酶末端補平，再通過T4?DNA連接酶將質粒重新環(huán)化并消除了質粒中的SalⅠ酶切位點，然后將該質粒經(jīng)pVU1和EcoR?Ⅴ雙酶切及KlenowF酶將末端補平，通過電泳回收3.8Kb片段，它含全長尿激酶原cDNA，并將該片段插入經(jīng)BglⅡ酶切，Klenow?F酶末端補平的pMTSV-dhfr中間載體，從而獲得一個長度為12Kb，能高效表達尿激酶原的載體pMTSV-du。

3．如權利要求1所述的一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于轉染和篩選高效表達的CHO工程細胞是將20-40微克表達載體pMTSV-du質粒DNA通過磷酸鈣共沉淀法轉染CHO-dhfr^-細胞，先用HAT選擇培養(yǎng)基篩選，10天后換成含1-3×10^-8MMTX選擇培養(yǎng)基進行dhfr和MTX雙重篩選，并對33株表達有尿激酶原活性的陽性轉化細胞多次亞克隆和MTX加壓擴增基因，再經(jīng)鋅離子誘導篩選出高效表達，活性達到500-800IU/10^-6細胞/天的尿激酶原工程細胞株。

4．如權利要求1所述的一種重組人糖基化尿激酶原的制備方法，其特征在于CHO工程細胞的高密度培養(yǎng)是用固體聚乙烯微載體Biosilon或SH-2和多孔纖維素微載體Cytopore在一個由灌流培養(yǎng)控制裝置的反應器內進行灌流培養(yǎng)，灌流量逐漸增加，使細胞密度達1-2×10⁷/ml，尿激酶原的產(chǎn)量隨細胞密度的增加而增加。