[發(fā)明專利]重組人糖基化尿激酶原的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 96119836.2
• 申請日: 1996-09-27
• 公開（公告）號: CN1062016C
• 公開（公告）日: 2001-02-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方繼明;肖成祖;余煒源;張正光;李風(fēng)知;黃子才;陳昭烈;葉建新
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所
• 主分類號: C12N15/58
• 分類號: C12N15/58;C12N15/85;C12N15/06
• 代理公司: 中國人民解放軍總后勤部專利服務(wù)中心
• 代理人: 吳嘉善

本發(fā)明是利用生物工程技術(shù)，對以下六種載體如pUC19,pMM-UK,pSV₂-dhfr,pSV₂-pro-UK,pXMT,pMTSV-dhfr上的有用元件，經(jīng)過重組，構(gòu)建一個適合在中國倉鼠卵巢(CHO)母細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因的新型載體(pMTSV-du)，然后將轉(zhuǎn)染篩選獲得的CHO工程細(xì)胞株CL-11G用微載體(Biosilon,SH-2,Cytopore)灌流培養(yǎng)技術(shù)和低血清培基進(jìn)行高密度培養(yǎng)，并對產(chǎn)品進(jìn)行四步或一步純化，制備一種治療冠狀動脈梗塞，腦血栓，中央視網(wǎng)膜動靜脈血栓及其他血栓病的藥物-重組人尿激酶原(prourokinase,簡稱pro-UK)，此屬于生物工程技術(shù)。

尿激酶原是尿激酶的前體，是一種糖蛋白，由411個氨基酸組成，其本身無活性，經(jīng)纖維蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其Lys¹⁵⁸-Ile¹⁵⁹之間的肽鏈打開形成尿激酶，才能發(fā)揮其溶血拴的效能。

自Bernit1973年發(fā)現(xiàn)pro-UK以來，已有人相繼從人的血液，尿液和各種重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)液中獲得，如用大腸桿菌培養(yǎng)液中獲得的有Holmes,W.E.?1985以及安內(nèi).布蘭法茲等(中國專利，CN?1042181A,1990-05-16)，用酵母表達(dá)成功的如Melnick,L.M.等(1990)用中國倉鼠卵巢(CHO)母細(xì)胞表達(dá)成功的有Nells,L.等(1987)；Avgerinos,G.C.等(1990)。

本發(fā)明包括：1．人尿激酶原全長cDNA基因的克隆，2．構(gòu)建在CHO細(xì)胞高效表達(dá)的轉(zhuǎn)移載體和工程細(xì)胞株，3．對CHO工程細(xì)胞的大量培養(yǎng)，獲得大量尿激酶原原料，并加以純化，其目的在于利用生物工程技術(shù)制備一種適于臨床應(yīng)用的糖基化尿激酶原產(chǎn)品。

本發(fā)明的技術(shù)要點是：

1．通過對Detroit?562細(xì)胞的誘導(dǎo)和提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和dG·dC接尾構(gòu)建了cDNA文庫，再通過篩選和人工合成寡核苷酸等DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了尿激酶原全長cDNA基因并克隆至pUC19質(zhì)粒DNA，獲得pMM-UK重組質(zhì)粒。

2．將幾種表達(dá)載體如pUC19，pMM-UK，pSV₂-dhfr，pSV₂-proUK,pXMT,pMTSV-dhfr，等載體上的有用元件，經(jīng)多次基因操作和重組，構(gòu)建了一個適合在CHO細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因的新型載體(pMTSV-du)。

3．采用微載體(Biosilon,SH-2,Cytopore)灌流培養(yǎng)技術(shù)和低血清培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)CL-11G工程細(xì)胞，獲得大量含高活性尿激酶原的原料。

4．采用四步法，即CM陽離子親和層析-MPG吸附層析-Sephacryl?S-200凝膠過濾-對氨基苯甲脒色譜，或采用一步法，即用抗體親和層析法純化產(chǎn)品。

實施例：

1．人尿激酶原全長cDNA基因的構(gòu)建和克隆：采用肉豆寇酯(PMA)誘導(dǎo)Detroit?562細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)尿激酶mRNA含量提高8倍以上，用酸性硫氰胍-酚-氯仿法提取細(xì)胞總RNA，oligo(dT)-纖維素柱層析法分離poly(A⁺)RNA,通過反轉(zhuǎn)錄和dG·dC接尾重組技術(shù)構(gòu)建了Detroit?562細(xì)胞的cDNA文庫，通過篩選獲得了含有編碼尿激酶基因片段的陽性克隆株。再采用人工合成寡核苷酸片段和DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了人尿激酶原全長cDNA基因并克隆至pUC19質(zhì)粒DNA，獲得了pMM-UK重組質(zhì)粒。全序列測定結(jié)果表明，cDNA基因全長為1565bp，含有60bp(20aa)信號肽序列，1233bp編碼序列(1-411aa)和272bp?3'非編碼序列。該基因5'端含有HindⅢ和EcoR?1單一酶切位點，3'端含有SalⅠ,XbaⅠ,SmaⅠ,KpnⅠ和SacⅠ?5個單一酶切位點，便于尿激原基因的克隆和表達(dá)。

2．中間載體1?pSV₂-pro-UK的構(gòu)建：將pSV2-dhfr載體用BglⅡ酶切后用Klenow?F酶補(bǔ)平，再用HindⅢ酶切，分離回收載體大片段；從pMM-UK質(zhì)粒DNA中，用HindⅢ和SmaⅠ雙酶切，分離pro-UK?cDNA；將載體大片段與pro-UK?cDNA連接形成可表達(dá)pro-UK的重組質(zhì)粒pSV₂-pro-UK。