[發(fā)明專利]一種新的人紅細(xì)胞生成素

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 96115004.1
• 申請日: 1996-01-05
• 公開（公告）號: CN1143116A
• 公開（公告）日: 1997-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 婁丹;徐莉萍;鄒鐘誠
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽三生藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12N15/12;C12N15/63;C12N5/18;A61K38/18
• 代理公司: 沈陽市專利事務(wù)所
• 代理人: 楊濱

本發(fā)明涉及一種人紅細(xì)胞生成素技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種人紅細(xì)胞生成素的基因克隆及其在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的方法。

紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一種重要的造血生長因子，在體內(nèi)，它可以特異性地刺激骨髓中紅細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖、分化，增加成熟的紅細(xì)胞從骨髓向外周血中的釋放量。腎臟是成年人體內(nèi)紅細(xì)胞生成素的主要產(chǎn)生部位，因腎衰竭引起的紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生減少會導(dǎo)致貧血。臨床上已經(jīng)將紅細(xì)胞生成素用于治療腎衰竭引起的貧血、AIDS病人因齊多夫定治療所致貧血以及腫瘤病人因化療所致的貧血，在手術(shù)及骨髓移植中，紅細(xì)胞生成素也得到較好的應(yīng)用。經(jīng)紅細(xì)胞生成素治療后，病人體內(nèi)紅細(xì)胞壓積及血紅蛋白水平明顯升高，對輸血的依賴性明顯降低，因此，紅細(xì)胞生成素的臨床應(yīng)用前景十分廣闊。

天然人紅細(xì)胞生成素主要是從貧血病人的血液或尿中提取，因其來源十分有限，無法滿足臨床及科研的大量需求。重組DNA技術(shù)的發(fā)展，為大量生產(chǎn)人紅細(xì)胞生成素提供了一條新的途徑。1985年以來，已有許多學(xué)者成功地在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)了人紅細(xì)胞生成素(Fu-kuen，Lin等，Proc.Natl.?Acad.Sci.USA，82：7580-7584，1985；Kenneth?Jacobs等，Nature，313：806-810，1985；Jerry?S.Powell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：6465-6469，1986；黃利文等，中國科學(xué)B輯，24：178-184，1994)。這些在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的基因工程人紅細(xì)胞生成素具有與天然人紅細(xì)胞生成素相同的體內(nèi)、體外活性。目前基因工程人紅細(xì)胞生成素的基因克隆及其在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)主要遵循如下方法。

1.編碼人紅細(xì)胞生成素的DNA片段的獲得：主要有兩種方式獲得編碼人紅細(xì)胞生成素的DNA片段。一種是提取胎肝染色體DNA，然后以特異性寡核苷酸為引物，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出人紅細(xì)胞生成素的基因片段，然后進(jìn)行體外拼接。另一種是提取人胎肝mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫。或是篩選人胎肝基因組文庫，得到編碼人紅細(xì)胞生成素的基因，切下人紅細(xì)胞生成素基因與表達(dá)載體相連接，導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，提取mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫。篩選cDNA文庫，得到編碼人紅細(xì)胞生成素的DNA片段。

2.編碼人紅細(xì)胞生成素的DNA片段與表達(dá)載體相連接。常用的表達(dá)載體有pDSVL、pSV2，這兩種質(zhì)粒帶有二氫葉酸還原酶(dhfr)基因，也可以用pDll，不含dhfr基因。

3.細(xì)胞株的構(gòu)建：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，經(jīng)篩選得到所需要的細(xì)胞株。常用的宿主細(xì)胞為COS細(xì)胞及CHO細(xì)胞。

根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，中國人紅細(xì)胞生成素的基因組成與結(jié)構(gòu)以及紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列與國外發(fā)表的文獻(xiàn)相同。EPO基因編碼區(qū)可編碼193個氨基酸，其中前27個氨基酸組成前導(dǎo)信號肽，其余166個氨基酸組成成熟蛋白，其分子量為18399D。重組EPO分子因糖基化程度及糖型組成不同，其分子量從26KD到34KD不等。

本發(fā)明提供了一種新的人紅細(xì)胞生成素及其生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法包括重組DNA載體的構(gòu)建，將重組載體DNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞，從上清中純化得到一種新的人紅細(xì)胞生成素。

本發(fā)明還提供了一種編碼人紅細(xì)胞生成素的新的DNA分子。該DNA分子的第418位堿基為C，已發(fā)表的文獻(xiàn)為G。

本發(fā)明還提供了一種新的人紅細(xì)胞生成素的氨基酸組成序列。該序列由193個氨基酸組成，其中前27個氨基酸組成信號肽，后166個氨基酸組成成熟蛋白，成熟蛋白的第113位氨基酸為Arg，而不是Gly。經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，表觀分子量為36～45KD，為一糖蛋白。本發(fā)明的人紅細(xì)胞生成素的衍生物也包括在本發(fā)明中。

本發(fā)明還提供了一種重組DNA分子。將編碼人紅細(xì)胞生成素的DNA片段與表達(dá)載體pCRIII相連接，得到重組質(zhì)粒pE/C。

本發(fā)明還提供了用于表達(dá)人紅細(xì)胞生成素的哺乳動物細(xì)胞。將質(zhì)粒pE/C與pDHFR共轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞，得到表達(dá)重組人紅細(xì)胞生成素的工程細(xì)胞株，其表達(dá)量超過10000U/ml·10⁶細(xì)胞，為現(xiàn)有細(xì)胞株表達(dá)量的2～3倍。

本發(fā)明還提供了含有一種新的人紅細(xì)胞生成素及其衍生物的藥品，在該藥品中本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素及其衍生物作為藥品的全部或部分活性組份。