[發明專利]絲氨酰組氨酸、磷酰化絲氨酸、磷酰化蘇氨酸用作核酸切割劑

無效

• 申請號: 96114313.4
• 申請日: 1996-12-13
• 公開（公告）號: CN1045448C
• 公開（公告）日: 1999-10-06
• 發明（設計）人: 趙玉芬;李向紅;麻遠;李永芳;萬榮;蔣宇揚
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C07H21/00
• 分類號: C07H21/00;C07K5/06;C07F9/02
• 代理公司: 清華大學專利事務所
• 代理人: 羅文群

本發明涉及絲氨酰組氨酸、磷酰化絲氨酸、磷酰化蘇氨酸用作核酸切割劑的新用途，屬生物技術領域。

DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是生物體的遺傳物質。對其結構和功能的研究，是分子生物學研究的主要內容之一。要研究核酸結構與功能的關系，就需要對核酸進行各種操作，如對核酸鏈的切割與連接等。而對核酸鏈的切割是核酸操作過程中必不可少的過程。目前，用以核酸鏈切割的核酸切割劑的種類有從生物體中分離的各種天然核酸酶或人工合成的模擬核酸酶以及其他種類的化學試劑。在此，將能夠以任何方式斷裂核酸鏈的試劑統稱為核酸切割劑。列述如下：

(1)天然核酸酶，即天然存在的具有水解核酸磷酸二酯鍵功能的酶。

其中限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA中特定堿基序列的核酸水解酶，其識別序列一般為4或6個堿基對的回文結構，切割產生的片段較短，不易得到完整的基因片段。其它的核酸內切酶和外切酶切割產生的核酸片段則更短。因此，現有的天然核酸酶不能滿足研究基因時需定點切割以得到大片段基因簇的要求。

(2)金屬及其絡合物

a、以自由基機理切割核酸的切割劑：其中包括EDTA-Fe(Ⅱ),Cu(Ⅱ)-硫醇，1,10-二氮雜菲-Cu(Ⅰ)，抗壞血酸-Cu(Ⅱ),Cu(Ⅱ)-Gly-Gly-His,CNBr-甲基硫醚，Mn(Ⅱ)-甲基肼，等。這類切割劑是通過產生自由基而斷裂核酸鏈，會產生活性自由基，本身就會造成對生物體的傷害，不能用于基因治療。

b、以酯基轉移反應機理切割核酸的切割劑：其中包括Zn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Co(Ⅲ)以及三價鑭系金屬離子，即(La,Ce,Eu,Gd,Tb,Lu)的胺類絡合物。雖然單純的Ln^a+可以有效促進RNA的切割，但是，必需精心選擇合適的配體才能得到有催化活性的金屬絡合物。另一方面，配體必需是熱力學穩定的，又要求在動力學上是惰性的，以防止金屬離子的釋放。另外，金屬絡合物同樣需要與識別系統偶聯才能達到定點切割的目的。因此，要使金屬離子能夠結合在與合適的識別劑相連的配基上，仍然是一關鍵。若將金屬絡合物用于生理條件下的治療，就更為嚴格。

c．以水解磷酸二酯鍵機理切割核酸的切割劑：其中包括Co(Ⅲ)、Ln(Ⅲ)等。目前報道的都需要較高的溫度。

(3)含咪唑基的化合物

這類切割劑主要是利用咪唑基作為一般酸堿催化劑達到水解RNA的目的。但不適合用于切割DNA。

本發明的目的是將已有的絲氨酰組氨酸、磷酰化絲氨酸、磷酰化蘇氨酸用于核酸切割。天然核酸酶本身數量有限，作用后產生的片段太小；以及以上所述的化學切割劑在應用上存在種種不足，本發明根據天然核酸酶活性中心對核酸的切割機理，利用天然氨基酸、小肽及其衍生物所具有的活性基團，以水解機理切割核酸，從而獲得與天然酶解產物相同的水解末端，為應用于分子生物學提供可行性。另外，為了應用于基因治療、抗病毒、抗腫瘤等，本發明使用的天然氨基酸、小肽及其衍生物，不會帶來毒副作用。

本發明的內容是根據天然酶活性中心的結構，設計并合成具DNA(脫氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)切割功能的化合物，屬于生物高技術探索領域。本發明采用絲氨酰組氨酸(Ser-His二肽)，磷酰化絲氨酸、磷酰化蘇氨酸的組氨酸溶液切割DNA及RAN。

1、Ser-His切割DNA及RNA

將Ser-His溶于無菌高純水，配成溶液。將此溶液與切割底物混合，被切割的核酸即切割底物為雙鏈線狀DNA(本發明中選用λDNA)、超螺旋質粒DNA(本發明中選用pUC8及pBR322質粒DNA)、RNA(本發明中選用poly和UpolyA)。以20mM(毫摩爾/升)的伯瑞坦-羅比森(Britton-Robison)(由磷酸、乙酸、硼酸組成，其濃度分別為0.04M)緩沖液作為緩沖體系，用氫氧化鈉調pH值在4.0-9.0的范圍。Ser-His的終濃度為1-200毫摩爾/升(mM)，底物的終濃度為0.05-50mM(按單個堿基的濃度計算)。將Ser-His與底物的混合物置于10-80℃下保溫，保溫0-96h取出，即完成對底物的切割。將切割后的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA采用紫外分光光度法檢測，其結果如下：在30℃以下切割現象不明顯；37℃時，5mM的Ser-His在保溫24h后即有明顯的切割現象。隨著溫度提高或Ser-His濃度的提高，切割速度加快；在50℃保溫4h，就有明顯的切割現象。在上述pH值范圍內，Ser-His都有切割活性。在pH值為7左右時，切割速度最快。

2、磷酰化絲氨酸、磷酰化蘇氨酸切割DNA及RNA