[發明專利]編碼ＢａlＩ限制－修飾系統酶的基因

無效

• 申請號: 96105959.1
• 申請日: 1996-02-02
• 公開（公告）號: CN1101469C
• 公開（公告）日: 2003-02-12
• 發明（設計）人: Ｈ·上野;石野良純;加藤郁之進
• 申請（專利權）人: 寶酒造株式會社
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/60;C12N15/63;C12N9/88;//;C12R113);C12R113)
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 姜建成

本發明涉及用作遺傳工程試劑的限制酶和修飾酶。具體地說，本發明涉及編碼BalI限制-修飾系統酶的基因，和用其制備BalI限制酶的遺傳工程方法。

由微白短桿菌ATCC?15831(本文以下稱Bal菌株)產生BalI限制和修飾酶系統，而且由具有DNA切割活性的BalI限制酶和保護DNA免于BalI限制酶切割的BalI修飾酶(也稱甲基酶或甲基轉移酶)組成。BalI限制酶屬于典型的II型限制酶。該酶識別含有具一旋轉雙軸結構的6個堿基(5′TGGCCA-3′)的序列，并在識別序列的G和C之間切割以得到平末端(Gelinas?et?al.，Journal?of?MolecularBiology，114，433-440(1977))。另一方面，BalI修飾酶有從識別序列的5′側，將一甲基導入第4位胞嘧啶堿基(C)的作用，因此，該酶可保護DNA免于BalI限制酶的切割。

在上述Gelinas等人的Journal?of?Molecular?Biology中描述了制備BalI限制酶的方法。然而，由于只能從BalI菌株得到少量的BalI限制酶，所以很難生產大量的該酶。認為只要克隆BalI限制酶基因就可經遺傳工程方法生產大量的BalI限制酶。在所述的情況下，就需要BalI限制酶基因和BalI修飾酶基因。

Wilson(Gene，74，281-289(1988)描述了作為克隆的不同修飾酶之一的BalI修飾酶基因。然而，有關BalI修飾酶基因的鑒定未經詳細描述，例如定義克隆它的方法和被克隆基因的結構或序列。另外也沒有BalI限制酶基因的報道。

本發明的首要目的是提供編碼BalI限制-修飾系統酶的基因，和通過產生新的微生物，特別是E.coli而制備BalI限制酶的方法，在所述新微生物中導入了質粒，所述質粒含有編碼BalI限制-修飾系統酶的基因，所述基因適宜工業化生產BalI限制酶。

參考附圖從下列描述中，本發明的該目的以及其它目的和優點對于本領域專業人員來說是顯而易見的。

圖1表明各缺失突變和修飾酶活性之間的關系。

圖2表明構建pBSRl的步驟。

圖3表明BalI限制和修飾酶基因的結構。

在第一方面，本發明涉及分離的BalI限制酶和可與其雜交的基因。這些基因有相等的功能。

在第二方面，本發明涉及分離的BalI修飾酶基因和可與其雜交的基因。這些基因有相等的功能。

在第三個方面，本發明涉及含有第一方面之基因的載體。

在第四個方面，本發明涉及含有第二方面基因的載體。

在第五個方面，本發明涉及含有第一方面和第二方面基因的載體。

在第六個方面，本發明涉及用可生產BalI限制酶的第三方面載體和第四方面載體轉化的轉化子。

在第七個方面，本發明涉及用可生產BalI限制酶之第五方面的載體轉化的轉化子。

在第八個方面，本發明涉及制備BalI限制酶的方法，包括培養第六方面或第七方面之轉化子，然后從培養液中收集BalI限制酶。

本發明人進行了深入細致地研究以致成功地克隆了含編碼Bal菌株之BalI限制-修飾系統酶的基因的DNA片斷。本發明人還發現在細胞中積累了很大量的BalI限制酶，通過培養微生物，特別是E.coli，從培養液中可以得到大量的酶，所述微生物攜帶含有限制和修飾酶基因的一個質粒或分別含這些基因的質粒。

本文所用的術語″BalI限制酶″從種屬上指具有BalI限制酶活性的多肽。

本文所用的術語″BalI修飾酶″從種屬上指具有BalI修飾酶活性的多肽。

編碼BalI限制-修飾系統酶的基因含有編碼切割DNA活性之BalI限制酶的基因和編碼保護DNA免于被BalI限制酶切割之修飾酶的基因。術語″編碼限制-修飾系統酶的基因″指含有限制和修飾酶基因，和其單個基因的基因。換句話說，該術語指限制和/或修飾酶基因。這些基因可以單獨或以復合體的形式使用。若使用上述兩個基因克隆的質粒時，可以將兩個基因克隆在相同質粒中，或也可以將這些基因分別克隆在不同的質粒中。

在本發明中，為了克隆編碼限制-修飾系統酶的基因，常常使用稱為載體修飾法或甲基酶選擇法的方法(Wilson，Gene，74，281-289(1988))。該方法是基于預期限制酶基因和修飾酶基因彼此靠近。即具有修飾酶活性的某些克隆應同時擁有同源的限制酶基因。

然而，該方法不能直接用于克隆編碼BalI限制-修飾系統酶的基因。