[發明專利]利用9、10-二氫化吖啶的水解酶的化學發光檢測

無效

• 申請號: 95194805.9
• 申請日: 1995-08-30
• 公開（公告）號: CN1156506A
• 公開（公告）日: 1997-08-06
• 發明（設計）人: 哈謝姆·阿克哈溫-塔夫蒂;扎拉·阿戈哈瓦尼;雷努卡·德席爾瓦
• 申請（專利權）人: 魯米根公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 柳沈知識產權律師事務所
• 代理人: 巫肖南

本申請是于1994年3月2日提出的申請系列NO.08/205,093和1994年4月15日提出的NO.08/228,290的連續部分，其中NO.08/205,093和NO.08/228,290為1993年5月17日提出的申請系列NO.08/061,810的連續部分。

本發明的領域

本發明涉及到一種改進的用化學方法產生光(化學發光)的方法，其中通過一種酶的作用產生一種促進過氧化物酶的反應性能的物質，而該過氧化物酶本身又催化化學發光反應。本發明也涉及應用這一方法來檢測第一種酶。本發明還涉及應用這一方法來分別檢測和測量各種生物分子，包括利用免疫檢測技術的半抗原、抗原和抗體，利用Western-印跡技術的蛋白質以及利用Sourthern和Northern-印跡技術的DNA和RNA。這一方法也被用來在DNA測序應用中檢測DAN。這一方法還可被用來檢測DAN突變。

有關技術描述

(a)10-甲基-(9、10)-二氫化吖啶-9-羧酸的烷基酯和芳香酯在強堿條件下在偶極非質子傳遞溶劑中通過自氧化形成N-甲基吖啶酮而產生化學發光(F.McCapra，“美國化學研究報告”(Acc.Chem.Res.)9(6)，201-8(1976))。化學發光的量子產額在10^-5-0.1的范圍內，據發現在酚和醇的離去基團的pKa下降時其量子產額會增加。由于中間介質的競爭性的不發光的分解，在水溶液中量子產額會非常低。加入陽離子表面活性劑CTAB，通過阻止競爭性的黑暗反應能增加130倍的表現量子產額。

申請人的同時待審查的申請系列：1993年5月17日提出的NO.08/061,810，1994年3月2日提出的NO.08/205,093以及1994年4月15日提出的NO.08/228,290公開了用于檢測過氧化物酶和辣根過氧化物酶(HRP)的化學發光的9、10-二氫化吖啶化合物。除申請人的前述的同時待審查的申請外，沒有其他任何靠利用過氧化物酶或其他酶氧化9、10-二氫化吖啶來產生化學發光的報導。

(b)增強酶的方案

頒發給Kricka的美國專利5,306,621描述了一種用酶法從無活性前增強子(pro-enhancer)產生用于辣根過氧化物酶(HRP)催化的氨基苯二酰一肼的化學發光的氧化反應的增強子的方法。沒有任何關于將9、10-二氫化吖啶用作化學發光的底物的建議。所報導的這一方法的相對低的靈敏度(10^-16mol堿性磷酸酶)對于很多應用都是不夠的。

已報導過用于堿性磷酸酶比色檢測的偶聯酶的階式反應器(D.M.Obzansky等人“臨床化學”(Clin.Chem.)，37，1513-8(1991))。在這個方案中，堿性磷酸酶產生一種與第二種酶的無活性形式起反應并將這種酶轉化為活性狀態的物質。第二種酶與其自身的底物反應產生H₂O₂。以隨后的比色方法來檢測H₂O₂。但關于化學發光檢測未作任何披露和建議。

曾報導一種化學發光的Western印跡方法，其中結合的HRP-抗體共軛物催化一種引起膜表面生物素-酚共軛物沉淀的反應。結合的生物素用于俘獲額外的HRP-抗生蛋白鏈菌素共軛物。被俘獲的酶通過氨基苯二酰一肼的化學發光來檢測(D.A.Wigle，N.N.Radakovic，S.L.Venance，S.C.Pang“生物技術”(BioTechniques?14，562-3(1993))。對利用9、10-二氫化吖啶作為化學發光的底物未作任何披露和建議。

已經知道有幾種涉及多酶的生物發光和化學發光的反應(A.Tsuji，M.Maeda，H.Arakawa，“分析科學”(Anal.Sci.)，5，497-506(1989))。對作用方式的仔細研究發現，與本發明相比，在這些方法的大多數中，僅有一個增強階段。所有后來的階段僅僅為達到最后的發光反應提供一個電子傳遞體系(electron?relay?system)。只有以利用堿性磷酸酶產生NADP⁺為基礎的比色方法才確實為雙重增強的方法(A.Johannsson，C.J.Stanley，C.H.Self，“臨床化學雜志”(Clin.Chim.Acta)148，119-24(1985))。已知還有一種基于同樣原理的熒光分析(D.B.Cook，C.H.Self，“臨床化學”(Clin.Chem.)，39，965-71(1993))。沒有講授或建議利用化學發光的參考資料。