[發(fā)明專利]從細(xì)菌中提取異源不溶性蛋白質(zhì)

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 95194734.6
• 申請(qǐng)日: 1995-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN1156481A
• 公開（公告）日: 1997-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: Y·阿爾羅伊;J·朱;R·康登
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 先靈公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N1/06;C07K1/14;C12P21/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 吳玉和,王景朝

發(fā)明背景

以含有編碼哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的DNA序列的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌是常用的方法。用細(xì)菌表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，可得到高產(chǎn)量的這種蛋白質(zhì)，它包含在細(xì)菌的包涵體內(nèi)。為了得到并純化這種蛋白質(zhì)，必須從細(xì)菌中提取出含有蛋白質(zhì)的包涵體。

在過去，分離包涵體的方法是通過離心發(fā)酵液體培養(yǎng)基(fermentation?broth)，除去上清，將細(xì)菌沉淀物重懸在緩沖液中，然后用機(jī)械方法，如均質(zhì)化處理或超聲處理，或者，用溶菌酶加去圬劑處理，使細(xì)菌細(xì)胞裂解。再將含有裂解細(xì)菌細(xì)胞的混合物離心，得到上清液和包涵體沉淀。包涵體沉淀物，是對(duì)細(xì)菌細(xì)胞體裂解和離心處理后得到的含有包涵體的沉淀。但是，這種處理方法包括離心含有活細(xì)菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基的第一步操作。在大批量的離心過程中，活細(xì)菌常常會(huì)以氣溶膠的形式被離心發(fā)散到周圍的空氣中。

美國專利4,958,007通過在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中加入甲苯或酸來首先使細(xì)菌滅活而解決了這個(gè)問題。然后將此培養(yǎng)基離心，除去上清液，將細(xì)菌沉淀物重懸在緩沖液中，并調(diào)整此懸液的pH，使最終pH為6-9。換句話說，就是將被酸化的發(fā)酵液體培養(yǎng)基的pH，調(diào)整到6-9。然后通過均質(zhì)化處理使細(xì)菌細(xì)胞裂解，從細(xì)胞中釋放出包涵體。這種方法避免了在離心過程中活細(xì)菌發(fā)散到空氣中；但是，如果使用甲苯滅活細(xì)菌，這種方法必須在防爆炸的房間內(nèi)操作，因?yàn)榧妆绞且兹夹缘?，它的氣霧會(huì)引起爆炸。而且，如果用酸滅活細(xì)菌，細(xì)菌沉淀物重懸于緩沖液中，再將懸液的pH調(diào)整至最終pH為6-9，這樣，會(huì)使原來可溶性的細(xì)菌蛋白質(zhì)變成不溶性的，結(jié)果導(dǎo)致包涵體沉淀中含有不可接受的高濃度宿主細(xì)菌蛋白質(zhì)。

因此，有必要對(duì)提取不溶性重組蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行改進(jìn)，改進(jìn)的方法應(yīng)該在離心之前就殺滅全部或絕大部分細(xì)菌，絕大部分宿主細(xì)菌蛋白質(zhì)應(yīng)保留在溶液中，占絕對(duì)優(yōu)勢的不溶性蛋白質(zhì)應(yīng)該是細(xì)菌表達(dá)的異源性蛋白質(zhì)。發(fā)明概述

本發(fā)明通過當(dāng)細(xì)菌尚存在于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中時(shí)，裂解這種表達(dá)異源性蛋白質(zhì)的細(xì)菌，隨后可任選地用酸處理滅活細(xì)菌，來滿足上述改進(jìn)要求。然后可以在不發(fā)散活菌的狀態(tài)下進(jìn)行離心。這種對(duì)細(xì)菌的裂解處理，顯著地降低了活菌的數(shù)量，并且可以在密閉系統(tǒng)中進(jìn)行操作，使含有活菌的液體培養(yǎng)基的發(fā)散降到最小程度，或者完全消除。用本發(fā)明方法獲得的包涵體含有更高純度的異源性蛋白質(zhì)，也就是說與按用現(xiàn)有的技術(shù)提取得到的包涵體相比較，這種包涵體含有更低濃度的不溶性細(xì)菌蛋白質(zhì)。

本發(fā)明提供了三種從表達(dá)異源性蛋白質(zhì)的細(xì)菌中提取含有異源性蛋白質(zhì)的包涵體的方法。

第一個(gè)實(shí)施方案包括如下步驟：

(a)在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中發(fā)酵表達(dá)異源不溶性蛋白質(zhì)的細(xì)菌；

(b)裂解包含在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌；

(c)離心該發(fā)酵液體培養(yǎng)基，得到包涵體沉淀和上清液；

(d)除去上清液，得到包涵體沉淀。

本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案包括如下步驟：

(a)在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中發(fā)酵表達(dá)異源不溶性蛋白質(zhì)的細(xì)菌；

(b)裂解包含在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌；

(c)在0-15℃的溫度下冷卻或保持該發(fā)酵液體培養(yǎng)基；

(d)向已均質(zhì)化處理的發(fā)酵液體培養(yǎng)基加入酸，使其pH達(dá)到大約2.0；

(e)在0-15℃的溫度下溫育被酸化的發(fā)酵液體培養(yǎng)基，以便殺滅所有殘存的未被裂解的細(xì)菌；

(f)離心該發(fā)酵液體培養(yǎng)基，得到包涵體沉淀和上清液；

(g)從包涵體沉淀物中除去上清液；

(h)將此包涵體沉淀懸浮在緩沖液中，得到懸浮液；

(i)將pH調(diào)整液加入到該懸浮液中，使懸浮液的pH達(dá)到6-9；

(j)裂解在步驟(i)的懸浮液中包含的懸浮固體；

(k)離心該懸浮液，得到含有異源性蛋白質(zhì)的包涵體沉淀和上清液；

(l)除去上清液，得到被分離出的含有異源性蛋白質(zhì)的包涵體。

本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案包括如下步驟：

(a)在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中發(fā)酵表達(dá)異源不溶性蛋白質(zhì)的細(xì)菌；

(b)裂解包含在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌；

(c)在0-15℃的溫度下冷卻或保持該發(fā)酵液體培養(yǎng)基；

(d)將硝酸加入到該發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，使其pH達(dá)到約2.0；

(e)在大約0-15℃的溫度下培育這種酸化的發(fā)酵液體培養(yǎng)基，以便殺滅細(xì)菌；

(f)使該液體培養(yǎng)基的pH上升到大約8.5；

(g)對(duì)此液體培養(yǎng)基作裂解處理；

(h)離心已裂解的液體培養(yǎng)基，得到包涵體沉淀和上清液；