[發明專利]非毒性、非產毒性、非致病性鐮孢屬表達系統及所用啟動子和終止子

無效

• 申請號: 95193875.4
• 申請日: 1995-06-15
• 公開（公告）號: CN1151762A
• 公開（公告）日: 1997-06-11
• 發明（設計）人: J·C·洛耶;D·L·墨耶;W·約德;J·R·舒斯特
• 申請（專利權）人: 諾沃諾爾迪斯克生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N5/10;C12P21/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 張閩

本發明涉及用于重組蛋白生產的宿主細胞.具體地講，本發明涉及非毒性、非產毒性、非致病性鐮孢屬(Fusarium)真菌宿主細胞，可將其用于重組蛋白，尤其是酶的高水平表達。本發明還涉及可用于該系統的啟動子序列和終止子序列。

近年來，由于將重組宿主細胞用于表達異源蛋白，已極大地簡化了大量有商業價值的蛋白質的生產，這種蛋白質原來只能從其天然來源中純化.目前，已有多種可選擇的表達系統，可從中選擇生產任何特定蛋白質所需的表達系統，包括原核宿主和真核宿主。適當表達系統的選擇通常不僅取決于宿主細胞產生適量產率所述蛋白質的能力，而且在很大程度上取決于預想的該蛋白質的最終用途。

盡管哺乳動物細胞和酵母細胞一直是最常用的真核宿主，但現在已開始認識到絲狀真菌是可用于重組蛋白質生產的很有用的宿主細胞.現在被利用或被推薦用于上述方法的絲狀真菌的例子有：粗糙脈孢霉(Neurospora?crassa)、Acremonium?chrysogenum、Tolypocladium?geodes、卷枝毛霉(Mucor?circinelloides)和Trichoderma?reesei，構巢曲霉(Aspergillus?nidulans)、黑曲霉(A.niger)和米曲霉(A.oryzae)。

鐮孢屬的某些種已被用作植物致病性研究和基因調控研究的模式系統，如尖鐮孢(Fusarium?oxysporum)(Dioletz等，1993，Gene131：61-67；Langin等，1990，Curr?Genet.17：313-319；Malardier等，1989，Gene?78：147-156和Kistler及Benny，1988，Curr，Genet.13：145-149)、腐皮鐮孢(F.solani)(Crowhurst等，1992，Curr，Gene.21：463-469)和大刀鐮孢(Fusarium?culmorum)(Curragh等，1992，Mycol.Res.97：313-317)。這些鐮孢菌不適用于異源蛋白的商品化生產，因為它們具有一些不理想的特征，例如，是植物病原體，或是會產生超過安全水平的真菌毒素。Dickman和Leslie(1992，Mol.Gen.Genet.235：458-462)披露了用一種帶有粗糙脈孢霉的nit-2的質粒轉化玉蜀黍赤霉(Gibberella.zeae)的方法。由Dickman和Leslie披露的玉蜀黍赤霉菌株是一種植物病原體，并能產生玉米赤霉烯酮-一種雌激素類真菌毒素。Sanchez-Fernandez等(191，Mol.Gen.Genet.225：231-233)披露了用一種帶有黑曲霉niaD基團的質粒轉化具有niaD突變的藤倉赤霉(Gibberellafujikoroi)的方法。

理想的表達系統應當是這樣的：它基本上不產生蛋白酶和真菌毒素，而且基本上沒有大量其它內源產生的分泌性蛋白，它能以比現有宿主細胞更高的水平表達。本發明現在就提供滿足上述要求的新型鐮孢屬表達系統。

本發明提供了一種重組的非毒性、非產毒性和非致病性鐮孢屬宿主細胞，它包括一個與一個啟動子可操縱連接的編碼一種異源蛋白的核酸序列.這里所說的“非毒性”是指該宿主細胞不是植物或動物的毒物。例如，如果以大約20ml(1∶1稀釋)培養3天的鐮孢屬培養基/kg體重/小鼠的劑量給大約5只小鼠注射鐮孢屬培養基約14天之后，這些小鼠中無一只因鐮孢處理而死亡的話，就認為這種鐮孢宿主細胞是非毒性的。這里所說的“非產毒性”是指經標準分析方法，如HPLC分析測定基本沒有真菌毒素的宿主細胞。例如，可用有機溶劑提取一定量的生長在盛有固體營養基的2×9cm培養皿上的鐮孢菌，并將該提取物的0.5％加注到HPLC中進行分析。通過沒有在真菌毒素標準的已知位置上出現可檢測到的HPLC峰這一現象，可以推斷沒有已知的真菌毒素。這里所說的“非致病性”是指該宿主細胞不會導致健康植株或健康動物明顯發病。例如，一種能使植物致病的鐮孢菌，會出現對植物木質部組織的真菌性侵入，并導致以典型的枯萎癥狀為特征的病態。這里所說的“異源蛋白”是指一種對該宿主細胞來說不是天然的蛋白質，或是一種已通過修飾使其天然序列發生改變的天然蛋白質，或是一種對其表達做過定量改變的天然蛋白質，這種表達的定量改變可以是對表達該天然蛋白質所需的天然調節序列，如啟動子、核糖體結合位點等進行操作的結果，或是用重組DNA技術對宿主細胞進行其它操作的結果。所述核酸序列可操縱連接在一個合適的啟動子序列上，該啟動子序列可指導所述核酸序列在所述選擇的宿主細胞中轉錄。