[發(fā)明專利]狂犬病毒疫苗病毒提純方法

無效

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• 申請日: 1995-03-25
• 公開（公告）號: CN1132027A
• 公開（公告）日: 1996-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫富林;趙林;李愛華
• 申請（專利權(quán)）人: 孫富林
• 主分類號: A01N63/02
• 分類號: A01N63/02
• 代理公司: 中國科學(xué)院武漢專利事務(wù)所
• 代理人: 黃文韜

狂犬病毒疫苗病毒提純方法屬于狂犬病病毒抗原醫(yī)用配制品的制備技術(shù)領(lǐng)域。

狂犬病是嚴(yán)重危脅人畜健康的一種傳染疾病。其防治藥品仍為狂犬疫苗。目前，國內(nèi)外所采用的是未經(jīng)提純病毒的細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，它的最原始的生產(chǎn)方法為羊腦增殖病毒，較為先進(jìn)的方法是利用人二倍體細(xì)胞和綠猴腎細(xì)胞生產(chǎn)狂犬疫苗。70年代，我國研制的地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬疫苗已取代了羊腦疫苗。但是用細(xì)胞培養(yǎng)狂犬疫苗，在生產(chǎn)工藝上存在以下缺陷：(1)疫苗不純，含有細(xì)胞碎片，這些碎片系人體的異性蛋白，它會導(dǎo)致人體局部或全身變態(tài)反應(yīng)。(2)效價低，以上兩指標(biāo)均未能達(dá)到WHO(世界衛(wèi)生組織)所規(guī)定的2.5iu(國際單位)/ml(毫升)，所以只能以2ml的含量代之(3)被注射者疼痛感明顯，重者有變態(tài)反應(yīng)最近，生物制品單位亦提出研制高純度的病毒疫苗，其路線是用超速離心技術(shù)，但由于這種裝置價格昂貴；使用壽命短；產(chǎn)出投入比低而未能實現(xiàn)檢索亦未發(fā)現(xiàn)與本內(nèi)容相同的發(fā)明曾向中國專利局提出過申請。

本發(fā)明的目的在于為醫(yī)用提供一種純度高，效價高，能達(dá)到世界衛(wèi)生組織規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，安全可靠的狂犬病毒疫苗制品的原材料，要求保護(hù)的技術(shù)方案如下：

狂犬病毒提純方法的設(shè)計構(gòu)思是反復(fù)和交替使用離心處理、調(diào)PH值和洗脫的方法，并通過紫外分光光度計檢測，取得病毒峰值液。其方法是將經(jīng)檢定合格(即無菌，LD₅₀達(dá)到10³～10⁴以上)的狂犬病毒細(xì)胞液經(jīng)離心處理，棄細(xì)胞，取狂犬病毒液；以醋酸調(diào)其PH值，經(jīng)搖勻并在低溫中靜止；再經(jīng)離心處理，除上清；取沉淀病毒，加EDTA溶液，使之懸浮；再調(diào)其PH值；經(jīng)離心處理，棄沉淀；將病毒液上樣層析柱上，并用緩沖液洗脫；經(jīng)檢測取出狂犬病毒峰值液。完成狂犬病毒疫苗病毒的提純過程。

下面就狂犬病毒疫苗病毒的一種提純方法的具體工藝過程，對本發(fā)明作進(jìn)一步地的說明。

1、取無菌的LD₅₀達(dá)10³～10⁴以上的狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)液為原材料。

2、棄細(xì)胞離心處理。將無菌的LD₅₀達(dá)到10³～10⁴以上的狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)液，以1000×g20分種離心處理，棄細(xì)胞，取上清，即狂犬病毒液。

3、用醋酸調(diào)PH值。將所取得的狂犬病毒液用醋酸將其PH值調(diào)到6.7。

4、搖勻靜止。用機(jī)械或人工方法，將調(diào)定到上述PH值培養(yǎng)液搖勻，再將之放于4℃的環(huán)境中，靜止20分鐘。

5、棄培養(yǎng)液離心處理，將靜止后的病毒培養(yǎng)液經(jīng)1000×g40分鐘離心處理，取出沉淀的狂犬病毒。

6、用Tris調(diào)PH值。在沉淀的狂犬病毒中加入EDTA溶液，使之懸浮，再用Tris將其PH值調(diào)到7.8。

7、棄雜質(zhì)沉淀離心處理，將調(diào)好PH值的狂犬病毒溶液經(jīng)1000×g20分鐘離心處理，棄雜質(zhì)沉淀，取上清，即狂犬病毒溶液。

8、洗脫。將上述狂犬病毒溶液上樣至用NT緩沖液(PH7.8)平衡好的Sephade×G75柱上，用NT緩沖液洗脫，其流速為1毫升/分。

9、檢測與收集病毒，利用紫外分光光度計對平衡好的Sephade×G75柱上洗脫的病毒液進(jìn)行檢測，收集和合并病毒峰，即完成提純工藝過程。

10、滅活。將收集到的狂犬病毒液加入1/4000～1/5000甲醛，再放入37℃恒溫室內(nèi)，靜止或旋轉(zhuǎn)24～34小時，即完成滅活過程。

11、檢定。可采用INH方法對經(jīng)滅活的狂犬病毒液進(jìn)行無菌試驗、毒力試驗、安全試驗和效力試驗后即成為狂犬病毒疫苗制品。

圖1是狂犬病毒疫苗病毒提純方法工藝流程圖。

本發(fā)明與背景技術(shù)相比，具有以下的有益的效果：(1)提高了病毒的純度，用本方法所提純的狂犬病毒不僅純凈，且達(dá)到了電子顯微鏡檢查純和血清學(xué)雙擴(kuò)散純的標(biāo)準(zhǔn)，并呈現(xiàn)一條病毒帶。(2)效價可以超過2.5iu/ml的指標(biāo)。達(dá)到或優(yōu)于WHO(世界衛(wèi)生組織)所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。(3)安全可靠，這是提高了純度和效價的必然結(jié)果。