[發明專利]能夠在沙門氏疫苗菌株表面表達酸免疫瘧疾抗原的重組表達載體

無效

• 申請號: 91108728.1
• 申請日: 1991-09-07
• 公開（公告）號: CN1060498A
• 公開（公告）日: 1992-04-22
• 發明（設計）人: 約西母·失爾;伯哈德·納浦;艾理卡·亨特;漢斯·庫浦;艾岡·阿曼
• 申請（專利權）人: 柏林魏克股份公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/30;C12N15/44;C12N15/31;C12N1/21;//A61K39/112;39/015;39/145
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 黃革生

本發明涉及新的重組表達載體，它能夠在沙門氏疫苗菌株表面表達瘧疾抗原HRPⅡ或SERP的致免疫肽。本發明還涉及含有該沙門氏菌并在通過口服接種后誘導哺乳動物體液免疫應答的疫苗。

瘧疾抗原HRPⅡ和SEPR已在下列文獻中進行過特征鑒定：EP-A2??0??315??085，Wellems??and??Howard，Proc.Natl，Acad.Sci.USA??83（1986），6065-6069，Knapp等人，Behring??Res.Commun.82（1988），349-359，EP-A1??0??283??882，Knapp等人，Mol.Biochem.Paras.32（1989），73-84，以及Higgins等人，Nature??340（1989），604。雖然部分上述文獻也公開過含有該抗原或其免疫活性部分的疫苗，但仍然需要提供一種適于誘發具有保護作用且可靠的體液免疫反應以對付引起瘧疾的原生動物如惡性瘧原蟲（P.falciparum）的改良疫苗。

在DE-A38??28??666和EP-A0357208中公開了可作為活疫苗應用的被轉化的細菌菌株。Hackett，Vaccine??8（1990），5-11總結了有關沙門氏菌疫苗領域的現有技術狀況。

構成本發明的技術問題是提供遺傳工程生產的沙門氏菌株，它適于在口服后通過誘導高水平的體液免疫應答而產生對瘧疾的保護性和可靠的預防作用。

以上技術問題是通過提供權利要求書中所定義的實施方案而得以解決的。

因此，本發明提供了包括以下成分的重組表達載體：

（a）一個強誘導啟動子;

（b）一個編碼革蘭氏陰性細菌雜化的OmpA蛋白的雜化基因;

（c）一個定位于OmpA基因中相應在OmpA蛋白的第三外環的克隆位點;和

（d）一個DNA序列，即

（da）被整體插入克隆位點（c），

（db）編碼能夠在哺乳動物中誘發體液免疫應答的瘧疾抗原HRPⅡ或SERP或其一部分，該瘧疾抗原最好得自惡性瘧原蟲。

術語“強誘導啟動子”是指在轉錄水平上對位于其下游的序列所編碼的蛋白質的表達具有高效控制作用的一個核苷酸序列，它可通過溫度轉移或加入化學物質（如IPTG）而被誘發。該強誘導啟動子的一個優選實例是受控于lac阻遏物的tac啟動子。

術語“克隆位點”是指含有限制性內切酶切割位點、適于整合所需DNA片段的一個DNA序列。

術語“在哺乳動物中能夠誘導體液免疫應答反應的瘧疾抗原HRPⅡ或SERP的一部分”是指對生產疫苗有用的HRPⅡ或SERP的區域。這種區域本領域熟練技術人員按照傳統方法可確定，例如應用傳統的計算機程序（可通過實驗證實T-細胞抗原決定基）。對于SERP，這種區域最好是與SH蛋白酶同源的區域，或含有T-細胞抗原決定基。在本文中術語“SH蛋白酶”是指在其活性部位帶有必需的半胱氨酸殘基的蛋白酶。術語“T-細胞抗原決定基”是指刺激由T-淋巴細胞介導的細胞免疫應答的一個氨基酸序列。

由本發明的重組表達型載體編碼的融合蛋白在表達后被轉運至細菌細胞壁，并按使瘧疾抗原HRPⅡ或SERP或其所說部分出現于外部環境的方式插入到細胞壁中。該表現方式通過使暴露于該轉化細菌宿主的哺乳動物免疫系統識別該瘧疾抗原并產物保護性免疫應答而發揮作用。該瘧疾抗原最好以與其天然形式相似的構象存在于本發明的轉化細菌宿主的表面。

在本發明的一優選實施方案中，重組表達型載體還包括：

（ca）被插入到所說克隆位點（c）的一個編碼流感血凝素（HA）蛋白1-48氨基酸和279-515氨基酸的DNA序列，在編碼HA蛋白的第46個氨基酸處含有第一克隆位點，在編碼HA蛋白的第400氨基酸處含有第二克隆位點，其中該DNA序列（d）被插入到DNA序列（ca）的至少一個所說的克隆位點。

在本發明的一個更優選實施方案中，所說的部分HRPⅡ由存在于重組表達載體pOmpA-6中的189個氨基酸組成，該載體的限制性內切酶的酶切圖譜示于圖1。

在本發明的另一優選實施方案中，重組表達型載體編碼由177個氨基酸組成的HRPⅡ的部分，它存在于具有圖1所示限制性酶切圖譜的重組表達型載體pOmpA-3中。

在本發明重組表達型載體的另一優選實施方案中，所說的SERP的部分含有一個與SH蛋白酶同源的區域。

在一最佳實施方案中，與SH蛋白酶有同源區域含有SERP的442-892、573-595或745-787位氨基酸。