[發(fā)明專利]用于檢測(cè)博氏疏螺旋體的生物測(cè)定

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 91105020.5
• 申請(qǐng)日: 1991-06-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1061245A
• 公開(kāi)（公告）日: 1992-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: R·N·皮肯;H·C·安蒙斯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 巴克斯特診斷技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/34
• 分類號(hào): C12P19/34;C12Q1/68;G01N33/50
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 曹恒興

本發(fā)明是我的申請(qǐng)日為1990年6月15日、申請(qǐng)?zhí)枮?/538，957的在先的懸而未決的申請(qǐng)的后續(xù)申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及一些用于檢測(cè)一些傳染物的核酸探針測(cè)定，這些傳染物存在于一些生物樣品中，含量極少。

萊姆（Lyme）病是一種由壁虱傳播的螺旋體屬博氏疏螺旋體（Borrelia??burgdorferi）引起的一些臨床病癥的綜合癥。它是在北美和歐洲由節(jié)肢動(dòng)物傳播的最常見(jiàn)的疾病。這種傳染的特殊形式包括慢性游走性紅斑、慢性萎縮性皮炎、淋巴細(xì)胞腦膜神經(jīng)根炎及萊姆關(guān)節(jié)炎。在這種病的第二和第三階段可觀察到嚴(yán)重危及神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的情況。各種臨床表現(xiàn)的變化類型以及該病癥與其他神經(jīng)性和風(fēng)濕性病癥的顯著類似造成了診斷的困難。關(guān)于萊姆病的臨床的及病原學(xué)的一般評(píng)論見(jiàn)Steere等人文章“N.Engl.J.Med.308：733”和“Duray，Rev.Infeet.Dis.112：S1487”。萊姆病除去嚴(yán)重的臨床病狀外，它對(duì)抗菌治療反應(yīng)極好，若能早期進(jìn)行診斷及適當(dāng)治療的話。然而，由于在感染后的最初的幾天或幾周內(nèi)沒(méi)有可用來(lái)進(jìn)行可靠的區(qū)別診斷的試驗(yàn)，這使得早期診斷無(wú)法實(shí)現(xiàn)。目前所用的一些診斷試驗(yàn)全是血清學(xué)方面的，包括間接免疫熒光法（IFA）、酶連接免疫吸收劑測(cè)定法（ELISA）及免疫吸印法（immunoblotting）。這些免疫學(xué)試驗(yàn)不可靠，因?yàn)樵缙诓∪酥挥?0%至60%在感染后最初3至6個(gè)星期內(nèi)具有可利用IFA或ELISA測(cè)量的診斷滴度。

此外，在帶有由蒼白密螺旋體（T.pallidum）引起的梅毒的一些病人中以及在帶有由赫氏疏螺旋體（BOrrelia??hermsii）引起的復(fù)發(fā)性發(fā)熱的一些病人中已報(bào)導(dǎo)過(guò)在IFA及ELISA法中出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。在以血清學(xué)為基礎(chǔ)的那些博氏疏螺旋體測(cè)定中普遍出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)是由于導(dǎo)致大多數(shù)結(jié)構(gòu)性決定因素的血清學(xué)交叉反應(yīng)性的很高程度的致病螺旋體之中的基因內(nèi)部關(guān)系。例如，可參見(jiàn)Magnarelli等人文章“J.Infeet.Dis.，156：183（1987）”。

對(duì)于血清學(xué)測(cè)定法的一種替代方法是這樣一種試驗(yàn)，該試驗(yàn)是基于所要連接的一些極特殊的靶順序的核酸探針的性質(zhì)。由于在萊姆病感染期間這種有機(jī)體本身數(shù)量極少，因此，必須首先擴(kuò)增所述靶核酸順序，使得產(chǎn)生信號(hào)的分子所附著的那些探針能以足夠的數(shù)量雜交，以產(chǎn)生能夠檢測(cè)的信號(hào)。基于這樣的探針的測(cè)定法的策略在于該靶順序是專門(mén)針對(duì)試圖檢測(cè)的那些種類的有機(jī)物，并且這些靶順序包括這些種類的每一個(gè)成員品系。

用于博氏疏螺旋體的核酸探針測(cè)定法必須能將這種有機(jī)體與那些密切相關(guān)的種類區(qū)分開(kāi)，尤其是復(fù)發(fā)性發(fā)熱的各種變種、赫氏疏螺旋體、扁虱疏螺旋體（B.parkeri）、特氏疏螺旋體（B.teri-cate）、西班牙疏螺旋體（B.hispanica）、以及回歸熱疏螺旋體（B.recurrentis）。對(duì)各種疏螺旋體屬的DNA同系性的研究表明同系性的變化程度，赫氏疏螺旋體顯示了最大同系性，從58%到63%，如Hyde及Johnson所報(bào)導(dǎo)的那樣[Zbl.Bakt.Hyg.A，263：119（1988）]。三個(gè)北美種類，赫氏疏螺旋體、特氏疏螺旋體及扁虱疏螺旋體，分別具有77%到100%的同系性，但歐洲品系與北美品系的比較顯示出基本上是種類內(nèi)部的變化。

在借助于核酸探針測(cè)定法檢測(cè)博氏疏螺旋體時(shí)，注意力集中在一些用于OspA和OspB表面蛋白質(zhì)抗原的探針。Nielsen等在“Mol.Cel.Probes，4：73（1990）”中報(bào)導(dǎo)了成功地探測(cè)了OspA的一個(gè)被擴(kuò)增的145個(gè)堿基對(duì)區(qū)段，以檢測(cè)相應(yīng)50個(gè)螺旋體的少至50fg博氏疏螺旋體DNA。人們發(fā)現(xiàn)該探針是專用于博氏疏螺旋體的，在這種情況下，對(duì)赫氏疏螺旋體、蒼白密螺旋體、齒垢密螺旋體（T.denticola）或S.aureus未觀察到交叉反應(yīng)性。然而，Persing等人在“J.Clin.Micro.，28：566（1990）”中報(bào)導(dǎo)了探測(cè)到大量真實(shí)的博氏疏螺旋體的隔離體的OspA區(qū)，并發(fā)現(xiàn)所述探針不能肯定地鑒別所有隔離體。這個(gè)結(jié)果的分子學(xué)基礎(chǔ)就是發(fā)現(xiàn)某些博氏疏螺旋體品系具有完全不同的OspA蛋白質(zhì)，或者根本沒(méi)有OspA蛋白質(zhì)，并且代之以一個(gè)被稱為PC的較小的蛋白質(zhì)。因此，目前尚沒(méi)有針對(duì)博氏疏螺旋體的權(quán)威性測(cè)定。