[發明專利]熱穩定性胞嘧啶脫氨酶

無效

• 申請號: 90104922.0
• 申請日: 1990-06-09
• 公開（公告）號: CN1052263C
• 公開（公告）日: 2000-05-10
• 發明（設計）人: 彼得·達納·森特;彼得·宗－達格·蘇;漢斯·馬夸特;馬薩·Ｓ·海登;彼得·林斯利
• 申請（專利權）人: 安柯金兩合公司
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N9/78;C12N15/63;C12P21/00;C12P19/30
• 代理公司: 上海專利商標事務所
• 代理人: 吳小燕

本發明大體上涉及胞嘧啶脫氨酶，更明確地說本發明涉及到純化和重組生產一種從啤酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)中獲得的熱穩定性胞嘧啶脫氨酶。

胞嘧啶脫氨酶(CDase，EC，3.5.4.1)催化下列反應使胞嘧啶水解成尿嘧啶。

已經從幾種不同的微生物中分離出這種在微生物嘧啶代謝中起著重要作用的酶(O′Donovan?and?Neuhard，1970)，但是沒有發現存在于哺乳動物細胞中(Nishiyama?et?al.，1985)。

從各種微生物中得到的胞嘧啶脫氨酶(CDase)的物理性質在分子量、穩定性和亞單位組成方面表現出明顯的差異性。例如從鼠傷寒沙門氏菌中得到的胞嘧啶脫氨酶已被純化成同種(通過SDS-PAGE)，是由4個分別為54千道爾頓(KDa)的亞單位組成(West等，1982)，而從大腸桿菌(Escherichia?coli)中得到的這種酶具有200千道爾頓(KDa)的分子量，是由35和46千道爾頓(KDa)的亞單位組成(Katsuragi等，1986)。這些酶都具有高度的熱穩定性，并且在55℃時保持高活性。

啤酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)也可以作為胞嘧啶脫氨酶的一個來源，以前從該酵母中得到的胞嘧啶脫氨酶的分子量，用凝膠過濾法測定為34千道爾頓(KDa)(Ipata等，1971，1978)，而通過SDS-PAGE和氨基酸分析測定為32—33千道爾頓(KDa)(Yergatian等，1977)。因而從前從啤酒酵母中分離出的這種胞嘧啶脫氨酶(CDase)是一種單體蛋白。

以前分離到的啤酒酵母胞嘧啶脫氨酶溶液，在4℃?PH為5-9之間存放時活性至少保持48小時(Ipata等，1971，1978)。但是在37℃下，一種啤酒酵母胞嘧啶脫氨酶的粗制品在1小時內活性失去一半(Kream?and?Chargaff，1952)，而這種酶的純制品具有30分鐘的半衰期(Katsuragi，1988)。通過將這種酶固定在環氧丙烯酸(epoxyacrylic)串珠上可以使其在37℃的半衰期提高到28天(Katsuragi?et?al.，1987)。因此，可以通過啤酒酵母胞嘧啶脫氨酶的熱不穩定性和它的低分子量，將它與早期所描述的細菌酶區分開。

在治療學上已經使用胞嘧啶脫氨酶。將前體藥物5-氟胞嘧啶(5-FC)轉化成抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)(Katsuragi?et?al.，1987；Nishiyama?etal.，1985；Sakai?et?al.，1985；Senteret?al.，1987)。盡管如此，由于需要大量地培養才獲得足夠的活性，在這種應用當中以細菌作為胞嘧啶脫氨酶的來源是不現實的(Sakai?et?al.，1985)。另外，微生物提取物給受體帶來一些不好的副作用。

使用酵母作為胞嘧啶脫氨酶的來源可以克服這些問題。但是，以往從酵母中所得產品由于具熱不穩定性在使用之前需要將這種酶進行固定(Katsuragi?et?al.，1987)。因此，分離和純化一種熱穩定性酵母胞嘧啶脫氨酶，可以提供一種應用于抗腫瘤治療中改良酶。同樣，對來自酵母的熱穩定性胞嘧啶脫氨酶基因的克隆，可以向該基因本身或控制其表達的序列中摻入特定的變體或附加物，以及在該基因和其他分子之間進行基因融合。這樣新的結構可以增強該酶在抗腫瘤治療中的療效或作用。

本發明基于從啤酒酵母中意外地發現了一種熱穩定性的胞嘧啶脫氨酶。對于這種酶的氨基酸順序分析顯示與其他已知蛋白質的順序沒有明顯的同源性。

本發明涉及一種編碼熱穩定性胞嘧啶脫氨酶或一種功能上等同的蛋白質的離體的核苷酸序列，和含有并且有效表達這種順序的重組體表達載體，被轉化的宿主細胞，以及利用重組體制備熱穩定性胞嘧啶脫氨酶或它的功能等同物的方法。

本發明還涉及到分離到的熱穩定性胞嘧啶脫氨酶，或一種功能上與它等同的蛋白質。其中一個優選實例是從啤酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)中分離到的胞嘧啶脫氨酶。

另外，根據本公開說明書，本發明與本領域內的普通技術具有相同的利益和作用。

在做為本說明書一部分的附圖當中：