[發明專利]熱穩定性胞嘧啶脫氨酶

無效

• 申請號: 90104922.0
• 申請日: 1990-06-09
• 公開（公告）號: CN1052263C
• 公開（公告）日: 2000-05-10
• 發明（設計）人: 彼得·達納·森特;彼得·宗－達格·蘇;漢斯·馬夸特;馬薩·Ｓ·海登;彼得·林斯利
• 申請（專利權）人: 安柯金兩合公司
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N9/78;C12N15/63;C12P21/00;C12P19/30
• 代理公司: 上海專利商標事務所
• 代理人: 吳小燕

1.一種產生編碼熱穩定性胞嘧啶脫氨酶的核酸的方法，其特征在于，該胞嘧啶脫氨酶是啤酒酵母的胞嘧啶脫氨酶而且其氨基酸序列如圖6或圖10所示，該方法包括：

(a)以啤酒酵母Saccharomyces?cerevisiae的基因組文庫為模板進行聚合酶鏈反應，以擴增出編碼熱穩定性胞嘧啶脫氨酶的核酸分子；

(b)分離出步驟(a)中擴增出的核酸分子，該核酸分子編碼氨基酸序列如圖6或圖10所示胞嘧啶脫氨酶。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，擴增出的核酸分子的核苷酸序列如圖10所示。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)中分離核酸分子是通過制備性的瓊脂糖凝膠電泳進行。

4.一種產生熱穩定性胞嘧啶脫氨酶的方法，其特征在于，該胞嘧啶脫氨酶是啤酒酵母的胞嘧啶脫氨酶，該方法包括：

制備啤酒酵母的自溶產物；

然后從該自溶產物中分離純化出啤酒酵母胞嘧啶脫氨酶，該胞嘧啶脫氨酶的氨基酸序列如圖6或圖10所示。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，制備啤酒酵母的自溶產物的步驟是通過：

(a)將啤酒酵母與乙酸乙酯混合，并加入磷酸鉀緩沖液，其中該緩沖液含有硫酸銨、EDTA和二硫蘇糖醇，從而制得啤酒酵母的自溶產物；

而且啤酒酵母胞嘧啶脫氨酶的分離純化的步驟是通過：

(b)離心步驟(a)中的自溶產物，收集上清液以去除細胞碎片，然后使上清液中存在的蛋白質沉淀；

(c)將該蛋白質沉淀溶解在含有EDTA和二硫蘇糖醇的緩沖液中；

(d)對沉淀物溶解后形成的溶液進行硫酸銨分級，從而使胞嘧啶脫氨酶與蛋白質的比例高于在蛋白質沉淀中的比例；

(e)將步驟(d)中形成的沉淀溶解在pH8.0的Tris緩沖液中，以從中去除多余的硫酸銨；

(f)在陰離子交換柱上進行陰離子交換色譜，其中洗脫液為含有二硫蘇糖醇的pH為8的Tris緩沖液，且線性梯度為0-0.3M?KCl，然后從陰離子交換柱上收集含有熱穩定性胞嘧啶脫氨酶的部分；

(g)將所述的含有胞嘧啶脫氨酶的部分置于凝膠柱，用含有二硫蘇糖醇的緩沖液洗脫，從該凝膠柱收集含胞嘧啶脫氨酶的部分，用pH7且含有硫酸銨、EDTA和二硫蘇糖醇的緩沖液對該含有胞嘧啶脫氨酶的部分進行透析，以產生含胞嘧啶脫氨酶的透析液；

(h)用pH7且含有硫酸銨、EDTA和二硫蘇糖醇的緩沖液，對該含胞嘧啶脫氨酶的透析液進行疏水交互作用色譜，用1.8-0M硫酸銨線性梯度洗脫胞嘧啶脫氨酶，然后收集含胞嘧啶脫氨酶的部分；和

(i)對步驟(h)的含胞嘧啶脫氨酶的部分，通過凝膠滲透柱，使用含二硫蘇糖醇的緩沖液進行凝膠滲透色譜，從而產生純化的胞嘧啶脫氨酶。?

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(a)、(c)、(f)、(g)、(h)、(i)中二硫蘇糖醇的濃度為0.1mM，在步驟(a)、(c)、(g)和(h)中EDTA的濃度為5mM。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中硫酸銨的濃度按重量/體積計為15％，在步驟(g)和(h)中硫酸銨的濃度為1.8M。