[發明專利]純尿激酶酶原與人血清白蛋白通過二硫橋鍵共價連接形成的血纖維蛋白溶酶原激活劑復合物

無效

• 申請號: 90103940.3
• 申請日: 1990-04-13
• 公開（公告）號: CN1049865A
• 公開（公告）日: 1991-03-13
• 發明（設計）人: 維克托·古列維奇;杰羅米·布雷頓
• 申請（專利權）人: 血管實驗室有限公司
• 主分類號: C12N9/72
• 分類號: C12N9/72;A61K37/48
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 曹恒興

本發明涉及使用尿激酶酶原作為溶解血栓的藥劑，以溶解患者體內的血纖維旦白凝塊。

尿激酶酶原（UK酶原）由單鏈組成，分子量為55千道爾頓，是雙鏈尿激酶（UK）的前體（酶原）。在美國再頒專利32，221中Husain等人對尿激酶酶原作了詳細描述，在本文中作為參考。單鏈尿激酶酶原經酶促轉化作用活化為雙鏈UK形式，其特征是轉移絲氨酸旦白酶家族到適當位置。尿激酶酶原通過靜脈注射后很快從血漿中清除，約為5-8分鐘。這一清除時間比它的活性衍生物即高分子量的雙鏈UK的清除時間短。

本發明描述了由純尿激酶酶原與人血清白蛋白（HSA）共價連接形成的血纖維旦白溶酶原激活劑復合物。形成的復合物可明顯延遲尿激酶酶原從血漿中清除，同時保留了溶解血纖維旦白的特性。本文所說的“尿激酶酶原”是指天然存在的或重組產生的UK酶原（UK酶原的任何酶原缺失突變型）、或者是任何具生物學活性的UK酶原的單鏈衍生物或片段，該衍生物或片段含有一個能與HSA的游離半胱氨酸殘基進行硫醇一二硫基轉換的胱氨酸殘基，在下文將詳細描述。本文所說的“HSA”是指天然存在的或重組的HSA。本文所說的“純”是指在使用前該復合物實質上（占重量的95%或更大）不含其它物質（如血液或組織培養物中的其他成分）。

由于本發明所述的復合物比UK酶原本身在體內具有更長的半衰期，因而提高了它在血栓溶解治療中的使用價值。而本發明的復合物不僅可預防血栓形成，而且能長期地預防心血管病變，如已知與血纖維旦白溶解活性受抑制有關的動脈粥樣硬化。

由于在體內的半衰期得到改善，本發明所述的UK酶原：HSA復合物可通過靜脈內注射方法用于治療。從而改進了UK酶原本身在治療中使用，因為UK酶原在體內的半衰期短，在治療時必須進行連續靜脈內注射，從而給治療帶來極大的不便，尤其是醫院外的治療。

本發明的其它特征和優點在下面描述的優選實施例和權利要求中能明顯地看出。

首先對附圖進行描述如下：

圖1（a）是完整的單鏈UK酶原分子的模式圖，（Holmes??et??al，Biotechnology（1985），3，923-929）;圖1（b）顯示單鏈UK酶原與HSA的共價連接。

圖2顯示UK酶原/HSA混合物在37℃中溫育4小時后過濾層析結果。收集0.5ml餾出物測定蛋白質含量（O）和血纖維旦白溶解活性（O）。

圖3是UK酶原在不同介質中溫育后的酶譜。

泳道2-在緩沖液中溫育

3-在HSA中溫育

4-在CBS血漿中溫育

5-在CBS血漿和HSA中溫育

6-在血漿中溫育。

7-10：表示經過α（HSA）-Sephadex柱后UK酶原與HSA一起溫育。

圖4顯示

泳道2-3表示純化的復合物的酶譜。

4-表示純化的復合物與α（HSA）溫育1小時后的酶譜，

以及通過α（HSA）-Sephadex柱后純化的復合物的酶譜。泳道3中的樣品在電泳前先在SDS緩沖液中煮沸2分鐘，而不用在37℃??SDS緩沖液中溫育30分鐘這一經典方法。

圖5中泳道2，3，4分別表示pH值為5，7.5，9時UK酶原與純化的HSA中溫育后的酶譜。泳道6，7，8分別是在Zn²⁺、Ca²⁺、以及Zn²⁺和Ca²⁺存在時UK酶原與純化的HSA溫育后的酶譜。泳道9是UK酶原與HSA濃度比為10時兩者一起溫育后的酶譜。

圖6中顯示

泳道2-UK酶原在緩沖液中溫育后的酶譜

泳道3、4、5和6分別表示UK酶原在血漿中溫育0小時、1小時、2小時、6小時、的酶譜。

7-表示UK在緩沖液中溫育后的酶譜。

8、9-分別表示在血漿中溫育0，6小時后的酶譜。

10-表示在濃縮尿中溫育后酶譜。

圖7是HSA經DFP和氯胺T處理（不影響形成復合物）以及BSA經DTT處理（使之恢復與UK酶原形成復合物的能力）后得的酶譜。

泳道1-UK酶原在緩沖液中溫育。

2-UK酶原與HSA一起溫育。

3-UK酶原與緩沖液處理的HSA一起溫育

4-UK酶原與DFP處理的HSA一起溫育

5-UK酶原與緩沖液處理的HSA一起溫育。

6-UK酶原與氯胺T處理的HSA一起溫育。

7-UK酶原以二聚體形式存在于緩沖液。

8-相同二聚體形式的UK酶原與BSA一起溫育。