[發(fā)明專利]抗促卵泡激素單克隆抗體及其制備和使用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 89100233.2
• 申請日: 1989-01-12
• 公開（公告）號: CN1035128A
• 公開（公告）日: 1989-08-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅德尼·約翰·菲德斯
• 申請（專利權(quán)）人: 邦奇(澳大利亞)有限公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N5/00;C12P21/00;A61K37/38;A61K39/395
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 孟八一,林玉貞

本發(fā)明涉及單克隆抗體及其制備和使用方法。

促卵泡激素（FSH或follitropin）是由垂體分泌的一種糖蛋白激素。FSH及其它垂體糖蛋白激素（促黃體激素LH，促甲狀腺素TSH）均由α亞基和β亞基構(gòu)成，這些激素的α亞基是相同的，而β亞基卻是不同的，它決定著各激素的特異性。

FSH與雄性動物和雌性動物的性功能有關(guān)，就雄性動物而言，F(xiàn)SH最重要的作用似乎是與精子成熟和營養(yǎng)有關(guān)，而對雌性動物來說，F(xiàn)SH起著促進(jìn)卵發(fā)育和排卵的作用。在胚胎轉(zhuǎn)移過程中，外源性FSH可用于加速排卵，或增加排卵，以得到更高的生殖力。然而，治療動物的應(yīng)答變化可能是主要問題，應(yīng)答變化可能是因為批料變化和在FSH中存在污染物，尤其是有其它垂體糖蛋白激素、LH（促黃體激素）存在之故。

現(xiàn)有技術(shù)中，提取羊FSH（oFSH）已知的主要方法包括：

（ⅰ）利用乙醇和酸沉淀，由羔羊垂體腺制備oFSH粗提物（Sherwood，et????al（1970）J.Biol????Chem.245：2329-2336），

（ⅱ）硫酸銨沉淀（Reichcrt，L.E.in????Methods????in????Enzymology????Vol.xxxvll????Fd.O′Malley????B.W.and????Hardman????J.G.Academic????Press????Inc.N.Y.1975）。

按照該方法，通過分批加入冷乙醇或硫酸銨，沉淀出不需要的蛋白質(zhì)。最后一次加入的乙醇或硫酸銨沉淀出活性組分及污染物。這些方法生產(chǎn)出含0.5-1.0iu/mg粗蛋白的FSH粗提物。

用垂體粗提物進(jìn)一步提純的步驟包括凝膠過濾和離子交換層析（Sherwood，et????al，1970，Sairam????1979，Grinecti????1974），得到的純化產(chǎn)品的效能為每mg總蛋白含110至188單位FSH。

但是這些方法帶來大量花費，浪費時間而且從每個垂體腺中提取的產(chǎn)品量也很少，其結(jié)果難以大量滿足獸醫(yī)的使用，尤其是具有穩(wěn)定效能的FSH。

因此，本發(fā)明的目的是克服或至少是減輕現(xiàn)有技術(shù)中諸多難點之一或幾個難點。

因此，本發(fā)明首先提供一種抗促卵泡激素（FSH）的單克隆抗體的制備方法，該方法包括：

提供能產(chǎn)生抗FSH抗體的B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞;

使B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合;

并繁殖生成的雜種瘤細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明制備單克隆抗體的方法還包括采集所述雜種瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。

能產(chǎn)生抗FSH抗體的B細(xì)胞可選自試驗動物的脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。該試驗動物可以是小鼠、大鼠等。該B細(xì)胞可從用FSH免疫的動物或從其致免疫的組織中獲得。BALB/C小鼠是最佳免疫動物。一次或多次免疫的動物可用作產(chǎn)生淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞的抗體源。最佳方法是用多次免疫的鼠的細(xì)胞用來制備融合細(xì)胞雜種。

骨髓瘤細(xì)胞可以是任何適宜的類型。現(xiàn)有技術(shù)中，眾所周知的從淋巴細(xì)胞瘤中形成的專門骨髓瘤細(xì)胞系，已用于產(chǎn)生雜種瘤的融合過程。

有幾個骨髓瘤細(xì)胞系可用來制備融合的細(xì)胞雜種，其中包括P3/x63-Ag8，NS-I型骨髓瘤細(xì)胞，例如P3/NSI/1-Ag4-1，Sp2/O-Ag14和S194/5XXO·BU·1。在本發(fā)明的實例中，NS-I型骨髓瘤細(xì)胞（取自BALB/C小鼠）是最佳細(xì)胞系。

為了產(chǎn)生抗體的脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雜種細(xì)胞，按照本發(fā)明的融合步驟包括將體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，混合比例大約為20∶1至1∶1，以10∶1為最佳。在能促進(jìn)細(xì)胞膜融合的一種或數(shù)種試劑存在下，進(jìn)行融合。理想的是將同類動物用作融合過程中使用的體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞源。所用的促融合劑可包括仙臺（Sendai）病毒或聚乙二醇（PEG）。

因為融合方法在很低頻率（例如當(dāng)脾用作體細(xì)胞源時，大約每2×10⁵個脾細(xì)胞只得到1個雜種）下產(chǎn)生能活的雜種細(xì)胞，所以最好有一種能從未融合細(xì)胞中尤其是未融合的骨髓瘤細(xì)胞中選出融合的細(xì)胞雜種的方法。在其它產(chǎn)生融合的細(xì)胞雜種中，一種測定所需的能產(chǎn)生抗體的雜種瘤的方法也是必需的。