[其他]人前脫脂蛋白A-I的表達

無效

• 申請號: 88103118
• 申請日: 1988-05-27
• 公開（公告）號: CN88103118A
• 公開（公告）日: 1988-12-14
• 發明（設計）人: 波蘭·阿萊克斯;哥伯特·簡;伍爾福特·厄恩斯特
• 申請（專利權）人: UCB公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N5/00;C12P21/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 李瑛

本發明涉及含有為人前脫脂蛋白A-I編碼順序的新的重組DNA序列，含這些DNA序列的克隆和表達載體，用這些表達載體轉化的宿主細胞及用這些新重組DNA序列，載體和轉化體生產人前脫脂蛋白A-I的方法。

人脫脂蛋白A-I（apo????A-I）是組成高密度脂蛋白（HDL）和淋巴乳糜微粒的主要蛋白。肝臟和小腸是合成該蛋白的主要場所。在這些器官內，該蛋白以前脫脂蛋白A-I的前體被合成。該前肽在細胞內被共轉譯切割，從而將前脫脂蛋白A-I分泌到血漿和淋巴液中。

前脫脂蛋白A-I有6個附加氨基酸（Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln），它們連接在脫脂蛋白A-I的氨基末端。當到達血管間隙時，該前體蛋白被一種特異蛋白酶（脫脂蛋白A-I前肽酶）酶解，得到成熟的脫脂蛋白A-I。

成熟的脫脂蛋白A-I是由243個氨基酸殘基組成的已知序列的一條未糖基化多肽（H.B.BREWER????et????al.，Biochem.Biophy.Res.Commun.80，（1978），623-630）;它作為血漿卵磷脂酶的一個輔助因子：膽固醇酰基轉移酶負責血漿中大部分膽固醇酯的形成。脫脂蛋白結構或生物合成上的缺陷可以導致血漿脂類轉運系統的紊亂和冠狀動脈疾病的發生。脫脂蛋白A-I和HDL在血漿中低水平是引起心臟病（心肌梗死）和其他動脈粥樣硬化性疾病的重要危險因素之一。為脫脂蛋白A-I編碼基因的突變與HDL水平的降低及早期冠狀動脈疾病有關。脫脂蛋白A-I和DHL是主要的血漿成分，其參與膽固醇從外周組織（動脈）向肝臟的轉運（稱之為膽固醇反向轉運）而使之從體內排出。由于膽固醇在血管中的積累是一個通道標志（hall-mark）和動脈粥樣硬化最重要的過程，通過供應脫脂蛋白A-I刺激膽固醇反向轉運，可以推遲和逆轉動脈粥樣硬化的進程，從而減少心臟病的發生。由前脫脂蛋白向脫脂蛋白A-I的熟化能以在血液中滯留時間不超過12小時的速率，在細胞外大量地發生。由于前脫脂蛋白A-I，既使不是唯一的，也是主要的成熟脫脂蛋白A-I的前體，它可用于治療任何時候的低HDL水平性疾病，如：先天性或獲得性缺陷病。由于脫脂蛋白A-I可用于治療，所以很多研究人員都在尋找大量生產脫脂蛋白A-I的技術。一般說來，這些技術都涉及從血漿中分離純化該蛋白。

一些出版物（P.CHEUNG????and????L.CHAN，Nucleic????Acids????Res.11.（1983），3703-3715;J.J.SEILHAMER????et????al.，DNA，3，（1984），309-317和日本專利申請No96998/86）均指出可用已知的遺傳工程技術得到為前脫脂蛋白A-I編碼的cDNA。R.LORENZETTI????et????al.，（見FEBS????Lett.194，（1986），343-346.）也指出脫脂蛋白A-I可以未切割的與β-半乳糖苷酶融合蛋白形式在大腸桿菌中表達。然而，令其以非融合蛋白形式表達成熟的脫脂蛋白A-I的努力一直未獲成功。

上面提及的日本專利申請No96998/86敘述了在大腸桿菌中表達人脫脂蛋白A-I的類似蛋白，該菌株是用含在tac啟動子控制下的脫脂蛋白A-I結構基因的質粒PHAIE-I轉化的。然而，該結構基因是不完整的，它由從+4到+243氨基酸的密碼子組成，開始于ATG轉譯起始密碼子。因此，所得表達產物含有N-端蛋氨酸（對應ATG密碼子），當其用于治療時會有副作用。

J.B.MALLORY等人（J.Biol????chem.262，（1987），4241-4247;PCT國際專利申請WO86/04920和WO87/02062）揭示了在中國倉鼠卵巢細胞（動物細胞培養物）中表達人脫脂蛋白A-I。所用組建細胞含整個人前脫脂蛋白A-I的基因。中國倉鼠卵巢細胞看來可將前脫脂蛋白轉化為成熟的脫脂蛋白形式，因為只有5-10%分泌的脫脂蛋白A-I蛋白質是前脫脂蛋白A-I，其余均為成熟的脫脂蛋白A-I蛋白。但該系統的產率相對較低，在24小時內0.55×10⁶個細胞只分泌25-30μg/ml的脫脂蛋白A-I。在PCT國際專利申請WO87/02062中，有一些例子是有關人脫脂蛋白A-I在其它宿主中的表達，如：在大腸桿菌（細菌宿主）和釀酒酵母（酵母菌）中。所用組建的菌株不含前脫脂蛋白的遺傳信息，所以所得蛋白不是人前脫脂蛋白A-I。