[其他]人紅血球生成素基因在穩定轉染的哺乳動物細胞中的高水平表達

無效

• 申請號: 87104424
• 申請日: 1987-06-26
• 公開（公告）號: CN87104424A
• 公開（公告）日: 1988-04-27
• 發明（設計）人: 杰里·S·鮑威爾
• 申請（專利權）人: 華盛頓大學評議會
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P12/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 林玉貞

本發明一般地涉及基因工程領域，具體說與重組基因的糖蛋白產物表達有關，更具體地說與從穩定轉染的細胞中高水平地表達有生物活力的人紅血球生成素有關。

紅血球生成素這一激素在調節紅血球生成、紅血細胞的形成以及由貧血導致的紅血球生成素缺乏中起著重要作用。由于缺少純的材料，對這個激素做詳細研究以及試圖用它進行替補治療一直都很困難。

人紅血細胞的產生，需要腎臟分泌成熟糖蛋白形式的紅血球生成素。在恒態時，這個激素在循環血液中濃度為每毫升10至18毫單位（128-230微微克），在嚴重的組織供氧不足（缺氧）刺激下，它的水平可以增加一千倍。提高激素水平可觸發骨髓中感受干細胞群的增生和分化，激活成熟紅細胞中血紅蛋白的合成，加速紅細胞從骨髓釋放進入循環，從而增加紅細胞量，改善供氧不足的局面。缺乏紅血球生成素的病人如慢性腎臟病人，常患有嚴重的貧血癥。

紅血球生成素是一個34-38千道爾頓的糖蛋白，分子量的約40%是糖類提供的。至少一個二硫橋是活力所需的，對此激素的結構所知甚少，其合成的詳情也未全清楚。最近分離到的CDNA和基因組克隆，提供了分析紅血球生成素產生的調節控制的機會，但是，還沒有表達足夠數量的有生物活力的人紅血球生成素以用于替補治療。

按照本發明公開的內容，有生物活力的人紅血球生成素可以由穩定轉染的哺乳動物細胞系進行高水平表達（每升上清液超過二百萬名義滴度單位），這就為臨床應用純的人紅血球生成素提供了巨大的來源。紅血球生成素的這一驚人的高水平表達，是通過用人紅血球生成素基團的ApaⅠ限制片段轉染宿主細胞系實現的。ApaⅠ限制片段的意義鏈有圖1所示的核苷酸序列。

圖1表示含有人紅血球生成素基因序列的2426個堿基對的ApaⅠ限制片段;

圖2繪出了含有比2426個堿基對的ApaⅠ限制片段的有代表性的質粒表達載體（pD11-Ep）;

圖3描繪的是另一個帶有ApaⅠ限制片段的表達載體（pBD-Ep）。

在較好的實施方案中，如圖1所示的通過基因工程構建的ApaⅠ限制片段被插入如圖2和圖3所示的哺乳動物表達載體中，然后將表達載體引入哺乳動物細胞系以發展穩定轉染的細胞，產生大量有生物活力的人紅血球生成素。所選擇的人紅血球生成素基因的ApaⅠ限制片段要能最高效率地轉錄紅血球生成素信使RNA，有效地轉譯RNA和進行轉譯后的修飾，以生成具有生物活力的成熟紅血球生成素糖蛋白。具體地說，重要的是將紅血球生成素基因5′端干擾序列除去，而保留增強子序列。為了保存有潛在價值的增強子序列，ApaⅠ限制片段中的內含子也被保留。在基因的3′端某些非轉譯序列也被保留，????使推測的調控序列最適化。由ApaⅠ片段提供的增強表達為以下實例所證實，在下述實例中，該片段與兩個啟動子和兩個細胞系合用均得到穩定的高水平表達的紅血球生成素。

提出下列實例是用以闡述發明的優越性，并幫助普通的專門技術人員掌握和應用本發明。這些實例無論如何都不是企圖限制本發明公開的范圍，或本專利證書所提供的保護。

實例1.基因克隆的提取

在λ噬菌體中構建的人基因組文庫（Cell，15：1157-1174，1978）用低嚴緊度雜交條件及在Cell，38：287-297，1984（特此引證）中所述的寡核苷酸探針混合物進行篩選。

寡核苷酸混合物系用Applied Biosystems合成儀制備，用³²P-ATP及T4多核苷酸激酶作末端標記。設計的合成寡核苷酸相應于氨基末端部分的氨基酸序列：

H₂N-Ala-Pro-?-Arg-Leu-Ile-Leu-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-

Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu-?-Ile-Thr-Asp-Gly-Gly-Ala

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