[其他]克隆限制修飾系統的方法

無效

• 申請號: 87104039
• 申請日: 1987-06-06
• 公開（公告）號: CN87104039A
• 公開（公告）日: 1988-03-23
• 發明（設計）人: 瓊·埃蘭·布魯克斯;金伯利·安·哈瓦德
• 申請（專利權）人: 新英格蘭生物實驗室公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N9/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 李瑛,顧柏棣

本發明是有關克隆限制修飾系統的方法，由此產生的克隆，和用克隆生產限制酶和（或）修飾酶的方法。具體講是有關DdeⅠ和BamHⅠ限制性核酸內切酶和修飾性甲基化酶的克隆以及這些克隆和酶的生產方法。

限制性核酸內切酶是天然存在于細菌中的一類酶，細菌中含有此酶的成分經分離提純可在實驗室中用于裂解DNA分子成為DNA片斷。此類酶的這種性質便于DNA分子的鑒定和基因成分的分部分離。已經證明限制性內切酶是現代遺傳學研究所不可缺少的工具，在遺傳工程和遺傳分析中被譽為生物化學的“剪刀”。

限制性核酸內切酶能夠識別DNA分子并結合在專一的核苷酸序列（“識別序列”）上。限制性核酸內切酶一旦與DNA結合上，就能在專一序列的內部或端部進行切割。不同的限制性核酸內切酶對不同的識別序列親和性也不同。目前從數百種細菌中已鑒定出有將近一百種不同的限制性核酸內切酶。

在每一種細菌中往往只含有極少量的限制性核酸內切酶。這類酶多根據來源菌的名稱命名。比如埃及噬血菌（Haemophilus aeqyptius）所合成的三種不同的限制性核酸內切酶分別命名為HaeⅠ，HaeⅡ和HaeⅢ。這三種酶的識別序列及切點分別為（AT）GGCC（AT），Pu GCGCPy和GGCC。再例如大腸桿菌RY（Escherichia coli RY₁₃）只合成一種限制性核酸內切酶，定名為EcoRⅠ，其識別序列為GAATTC。

事實上，限制性核酸內切酶對細菌細胞的生長具有保護作用，它可使細菌抵御外源DNA分子的入侵，如病毒和質粒DNA，這種外源DNA可破壞或寄生于細菌細胞。限制性核酸內切酶可沿外源DNA分子掃描，每發現一個識別序列就進行切割，從而使細菌對外源DNA具有抗性。切斷了的外源DNA不能成為入侵基團并且對非專一性核酸內切酶的進一步降解作用更加敏感。

細菌保護系統的另一成分是修飾性甲基化酶。這類酶與限制性核酸內切酶在功能上互補能夠識別和區分內外源DNA。修飾性甲基化酶在DNA上的識別及結合序列與相應的限制性核酸內切酶相同，但不打斷DNA。此酶只在識別序列內某一個或另一個核苷酸殘基上進行化學修飾即加上一個甲基基團。甲基化后的識別序列不再被限制性核酸內切酶結合或切斷。細菌細胞的DNA在甲基化酶的作用下充分甲基化，因而細菌DNA對內源性限制性核酸內切酶的存在絲毫不敏感，只有未被甲基化的，外源性的DNA才易被限制性核酸內切酶所識別和攻擊。

隨著遺傳工程技術的發展，目前有可能用克隆基因的方法來生產蛋白質和酶，比起常規提純的方法其基因的編碼量要大得多。分離限制性核酸內切酶克隆的關鍵是找到一種簡單可靠的方法在復雜的“庫”中鑒別出這種克隆。即在克隆頻率為10^-4到10^-3用“鳥槍法”誘導克隆的程序。較優選的方法是能使大量不需要的克隆被破壞掉，而少量理想中的克隆被保留下來。