[其他]肽定序的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 87100897
• 申請日: 1987-02-20
• 公開（公告）號: CN87100897A
• 公開（公告）日: 1987-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬克·L·斯托洛維茲
• 申請（專利權(quán)）人: 分析化學(xué)國際有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊九昌,曹恒興

本發(fā)明涉及到一種對肽及蛋白質(zhì)進行化學(xué)定序的方法，其目的是確定組成肽及蛋白質(zhì)的各個氨基酸的種類及位置。更具體地說，本發(fā)明涉及到超過經(jīng)典的Edman降解系統(tǒng)的一種改進的方法。

天然存在的及近代由合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和多肽都是由氨基酸長鏈組成的化合物。在所有的生命體中都發(fā)現(xiàn)有蛋白質(zhì)并在生命體中具有激素、結(jié)構(gòu)基本成份、酶、免疫球蛋白及生命物質(zhì)的其他組份的功能。關(guān)于蛋白質(zhì)的功能及結(jié)構(gòu)的研究，經(jīng)常需要確定蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序（一級結(jié)構(gòu)）。為了用化學(xué)方法或應(yīng)用重組體DNA技術(shù)來合成蛋白質(zhì)或部份蛋白質(zhì)（如生長激素抑制素、胰鳥素、內(nèi)啡肽等），在嘗試進行合成之前通常必須確定該種蛋白質(zhì)所含的氨基酸順序。在包括蛋白質(zhì)（如免疫球蛋白、酶、病毒外殼蛋白及細胞表面蛋白）功能的探索中，在試圖闡明蛋白質(zhì)作用的機理時，必須確定蛋白質(zhì)或多肽的一級結(jié)構(gòu)。在重組體DNA方法研究中，必須確定一級結(jié)構(gòu)以闡明為該一級結(jié)構(gòu)編碼的相應(yīng)的DNA或RNA結(jié)構(gòu)。

在測定蛋白質(zhì)或多肽中氨基酸的基本順序時，通常是用一種逐步降解法，在該方法中，將單個的氨基酸逐個地從多肽末端除下以便進行鑒定。Edman降解作用是較好的方法，但是也發(fā)展了一些其他的方法并可在某些情況下應(yīng)用。在Edman降解作用中，是使N-末端氨基酸殘基與一種能有選擇性地從蛋白質(zhì)上除下該氨基酸殘基的試劑來進行反應(yīng)以從蛋白質(zhì)的末端除下氨基酸。所除下的氨基酸衍生物可轉(zhuǎn)變成一種穩(wěn)定的化合物，用化學(xué)方法可將該化合物從反應(yīng)混合物中分離出來并進行鑒定。

在五十年代由Edman提出的逐步降解蛋白質(zhì)及肽的方法〔Edman，P.，斯堪的納維亞化學(xué)學(xué)報，4，283（1950）〕在過去35年中幾乎沒有什么改變，如圖1所示，該三步的反應(yīng)過程包括在堿性或無水條件下，在一種溶劑中，使含有N氨基酸的一種肽的N-末端氨基酸偶合到異硫氰酸苯酯（PITC）上（圖1A）。用液-液萃取法（通常用重復(fù)的步驟）除去過量的試劑（過量500至10，000倍克分子）并在真空中除去溶劑。然后用無水酸使N-末端氨基酸裂解以形成氨基-末端氨基酸的一種苯胺基噻唑啉酮（ATZ）衍生物以及N-1長度的氨基酸的一種游離肽的鹽，此種肽是除去了末端氨基酸的原本的肽。圖1B。在真空中除去裂解的酸并從留在液相中的殘余肽中萃取氨基酸的ATZ衍生物。然后，接著就使這種及不穩(wěn)定的ATZ氨基酸與酸的水溶液反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成一種較穩(wěn)定苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）氨基酸。圖1C。然后將此縮短了的殘余肽（N-1氨基酸）用PITC處理以引發(fā)另一次降解循環(huán)。然后用色譜法鑒定所得到的PTH氨基酸。對于肽中的每個末端氨基酸，用重覆上述的步驟處理。

液相手動的EDMAN技術(shù)

在發(fā)展的早期，Edman降解技術(shù)是用手動來進行的。反應(yīng)室是一支試管或相似的容器，有時使用一種特殊的罩子，使試劑的添加及除去可在一種惰性氣氛中進行。用注射器或移液管來加入試劑而試劑的清除則用真空操作或?qū)⑵淙芙饣蜉腿∪胍环N溶劑中。在偶合的過程中，將蛋白質(zhì)或肽溶解于一種堿性偶合緩沖液中。這種方法對于大的蛋白質(zhì)分子是無效的，因為它們相對地不溶于這種堿性介質(zhì)中。

在偶合之后，在除去偶合緩沖液及不需要的付產(chǎn)物時出現(xiàn)了許多問題。在這種技術(shù)中的一個難題是所留下的肽衍生物可能干燥成為一種膠質(zhì)薄膜，而難以從其中除去反應(yīng)的付產(chǎn)物。應(yīng)用冷凍-干燥的一些方法試圖減輕這一難題。另一個非常大的難題是除去非揮發(fā)性物質(zhì)，因為在將這類物質(zhì)除去時，肽的PITC衍生物也易溶于同一溶劑中，因而要未留下過量的PITC要未就是使樣品損失。有一種方法是將揮發(fā)的試劑除去而留下干的PITC-衍生物及不揮發(fā)的付產(chǎn)物。然后選擇一種或幾種易于溶解不需要的物質(zhì)而較難溶解PITC-肽的溶劑來洗滌該剩余物。然而那些需要除去的物質(zhì)易于被截留在不溶的PITC-肽的基體中。另一方法是將PITC-肽及其他物質(zhì)溶于一種含有非極性溶劑的偶合緩沖液中并攪拌之，而非極性溶劑與偶合緩沖液是不相混的。這些其他物質(zhì)在非極性溶劑中的溶解度很大故可用此種溶劑萃取，而留下極性較強的PITC-肽則溶于極性的緩沖液中。溶有可溶解物質(zhì)的非極性溶劑可形成一個分離層，而此分離層可用移液管將之除去。但是此步驟似乎將某些PITC-肽萃取到非極性溶劑中。要除去萃取溶劑而不同時除去一定數(shù)量的PITC-肽和極性溶劑而且也不讓氧氣進到容器中是極難辦到的。