[其他]鹿茸組織細(xì)胞培養(yǎng)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 86107913
• 申請(qǐng)日: 1986-11-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1003177B
• 公開(kāi)（公告）日: 1989-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高云;吳玉林;王斌;李春義;程利平;趙世珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 高云
• 主分類號(hào): C12N5/02
• 分類號(hào): C12N5/02
• 代理公司: 農(nóng)牧漁業(yè)部專利事務(wù)所
• 代理人: 劉軍,陳如明

本發(fā)明屬于鹿茸組織細(xì)胞培養(yǎng)方法。

直到提出本發(fā)明為止，與本發(fā)明相近的研究是MorrismBubenikG.A.對(duì)激素與生茸關(guān)系的研究[CA：100：45542C（1984）]。該研究只是在鹿體上探明了雄激素對(duì)茸骨成熟和骨化作用，并未涉及鹿茸組織細(xì)胞在離體條件下的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的目的是將鹿茸組織細(xì)胞移植于培養(yǎng)瓶中，在離體條件下，賦予人工生長(zhǎng)環(huán)境，建立完善的鹿茸組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，使鹿茸組織細(xì)胞繁延于培養(yǎng)瓶中，獲得試管型鹿茸細(xì)胞。

本發(fā)明的特征在于所采用的培養(yǎng)液配方為（1）1%MEM液69-96%、雙抗1%、小牛清3-30%、PH6.8-7.3。（2）1%MEM液69-96%，雙抗1%、鹿血清3-30%，PH值6.8-7.3;選擇未分化的間充質(zhì)或者前成軟骨細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞分散處理，接入培養(yǎng)液（1）或（2）中，細(xì)碎粒與培養(yǎng)液比例為1∶50（g/ml），鹿茸細(xì)胞懸液與培養(yǎng)液比例為1∶25（ml/ml），置于培養(yǎng)瓶，在36-38℃條件下，培養(yǎng)14-21天，成為試管型鹿茸細(xì)胞。

經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)得到的液體，含有大量鹿茸細(xì)胞，該種鹿茸細(xì)胞具有良好的分裂增殖能力，稱為人工離體培養(yǎng)鹿茸的試管型前成軟骨細(xì)胞。這種試管型前成軟骨細(xì)胞，經(jīng)若干次分裂后，可圓縮分化為其性質(zhì)相當(dāng)于鹿茸“臘片”部位組織的試管型前成軟骨細(xì)胞。因此，其藥用價(jià)值超過(guò)一般鹿茸。此外，本發(fā)明無(wú)論對(duì)采自鹿體的二杠茸、初角茸、去勢(shì)茸和畸形茸，均能培養(yǎng)出試管型鹿茸細(xì)胞，而且用該技術(shù)培養(yǎng)的試管型鹿茸細(xì)胞存在著異常強(qiáng)烈的生命力和繁延能力，超過(guò)其它哺乳動(dòng)物的任何組織細(xì)胞。

下面按操作過(guò)程詳細(xì)敘述本發(fā)明的培養(yǎng)方法：

1、材料選取：選擇1-5歲的健康鹿鋸茸，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行清洗、消毒，用無(wú)菌器開(kāi)口，剝下茸皮，采取增生帶組織未分化的間充質(zhì)或者前成軟骨細(xì)胞。

2、細(xì)胞分散處理：細(xì)胞分散處理有兩種方法。一種是細(xì)胞細(xì)碎粒的制備，將采取的鹿茸增生帶組織細(xì)胞用兩把尖刃刀，在滴有血清的玻片上，對(duì)刃分割鹿茸組織，直到不能分割的細(xì)碎粒為止。另一種是細(xì)胞懸液的制備，將采取的鹿茸增生帶組織細(xì)胞切成小塊，放入搗碎機(jī)內(nèi)，加入1%MEM液，（MEM液從美國(guó)購(gòu)進(jìn)，系FlowLaboratoriesInc的產(chǎn)品，產(chǎn)品序號(hào)10-121-24）。其鹿茸組織塊與1%MEM液比例為1∶3（g/ml），開(kāi)機(jī)3-5分鐘，停幾分鐘后，再開(kāi)機(jī)，經(jīng)數(shù)次搗細(xì)成細(xì)胞懸液。

3、培養(yǎng)液的制備：本發(fā)明所用的培養(yǎng)液有兩種，可任選一種。培養(yǎng)液1的配方比為：1%MEM液74%、雙抗1%（雙抗為青霉素和連霉素。其配制方法，請(qǐng)參考《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》高等學(xué)校教學(xué)參考書(shū)，汪德耀主編，人民教育出版社出版·1981年12月第1版第188頁(yè)），小牛血清25%，PH值為7.0-7.2。培養(yǎng)液2的配方比為：1%MEM液74%、雙抗1%、鹿血清25%，PH值為7.0-7.2。

4、試管型鹿茸細(xì)胞的培養(yǎng)。將經(jīng)過(guò)分散處理的增生帶組織細(xì)胞接入培養(yǎng)液中，其比例為：細(xì)胞細(xì)碎粒與培養(yǎng)液1∶50（g/ml）;鹿茸細(xì)胞懸液與培養(yǎng)液1∶25（ml/ml）;裝于培養(yǎng)瓶中，蓋好瓶塞，輕輕搖動(dòng)，放在37℃條件下，培養(yǎng)成試管型鹿茸細(xì)胞。

5、細(xì)胞傳代：試管型鹿茸細(xì)胞在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)14-21天后，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代時(shí)，先傾出原培養(yǎng)液，用無(wú)鈣、鎂去離子液（FCE）洗數(shù)次，加ATV消化（ATV購(gòu)自美國(guó)SIGMA化學(xué)公司，產(chǎn)品序號(hào)87F-05525），再加培養(yǎng)液1或培養(yǎng)液2進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。