[其他]利用啤酒酵母基因BAR1分泌異種蛋白的方法

無效

• 申請號: 86107554
• 申請日: 1986-10-25
• 公開（公告）號: CN86107554A
• 公開（公告）日: 1987-08-26
• 發明（設計）人: 維維安·L·麥凱
• 申請（專利權）人: 維維安·L·麥凱
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P21/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 劉元金

本申請是1985年10月25日提交的流水號為791，305申請的后繼申請。

本發明涉及新的DNA結構，該結構至少含有啤酒酵母（Saccharomyces????Cerevisae）BAR1基因的轉譯信號肽部分以及至少一個與用所述基因轉化的宿主細胞無關的結構基因。用這樣的結構去轉化宿主生物可導致表達一種初級表達產物，該產物包含由融合到BAR1信號肽上的異種基因編碼的結構蛋白，結果可使該蛋白通過宿主細胞的分泌途徑加工并從宿主細胞分泌到培養基或周質空間中。

各種各樣的原核和真核微生物已被用作通過DNA重組技術生產不能由宿主自然產生的異種多肽的宿主。人們對真核生物中的各種真菌具有特別的興趣，包括啤酒酵母菌、梨酒酵母菌（Schizosaccharomyces????Pombe）、曲霉菌屬（Aspergillus）和脈胞菌（Neurospora）。尤其是對屬于芽生酵母的啤酒酵母菌作了許多工作。用一個合適的DNA結構如質粒轉化酵母細胞，已能使其表達包含在該質粒中的異種基因。然而，這一技術的主要限制是，在許多場合下，宿主細胞不能將這種蛋白產物分泌到介質中，所以必須破碎這些細胞，并在不使其變性或失活的情況下從各種污染的細胞成分中純化所希望的蛋白質。所以，希望能引導這些轉化細胞分泌能簡化產品提純步驟的異種產物。此外，希望一些蛋白質進入到宿主細胞的分泌途徑以便于進行合適的后加工，即形成二硫鍵。

已知啤酒酵母菌分泌一些天然產生的蛋白質，但是，有關這一過程的知識與由細菌和哺乳動物細胞分泌蛋白質所知道的相比是十分有限的。大多數分泌出來的酵母蛋白質似乎都是保持在周質空間的酶，但轉化酶和酸性磷酯酶也可能與細胞壁結合。已知由啤酒酵母菌分泌到培養基中的蛋白質包括接合信息素（α-因子和α因子）、致死毒素以及引起Barrier活性（以下簡稱“Barrier”）的蛋白質。穿過細胞壁進入介質中的分泌也稱為“輸出”。啤酒酵母菌的接合型α細胞產生分泌到培養基中的α-因子，而α細胞產生兩種分泌多肽，α-因子和Barrier因子。α-因子的基因已進行了克隆、序列測定和分析（見Kurjan和Herskowitz，Cell????30∶933-943，1982）。信號肽（一種被認為是引導細胞分泌一種附著蛋白質的短肽序列）、引導序列（Leader????Sequence）（包括一個從成熟的α-因子上切下的多肽前體）和來自α-因子的非轉譯基因序列（包括啟動子和調節區）可用于引導在酵母中產生異種蛋白的分泌（Brake等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA????81∶4642-4646，1984）。α-因子的表達由MATα1基因產物調節，而且將α-因子前體加工成成熟的蛋白質似乎至少需要兩步，并認為是處于STE????13和KEX2基因的控制之下。

與α-因子相對比，Barrier因子基于它與伴刀豆球蛋白A結合的能力似乎是糖基化的。Barrier因子是由α細胞產生，其表達似乎是在MATα-2基因的控制之下。除了可能的信號肽切割外，至今未表明Barrier因子前體的加工，而且認為STE13和KEX2基因與Barrier因子的表達無關。

由于在α-因子和Barrier因子的表達控制和加工之間有上述不同，人們無法事先確定這些酵母基因中的那一個更適于引導分泌一個特定的異種蛋白。由于這兩種蛋白質似乎是通過不同的分泌途徑而加工的，所以希望利用Barrier因子分泌系統的特征。

因此，本發明的一個目的是要提供這樣的DNA結構，它含有至少編碼信號肽的BAR1基因片段，還包含一個外來結構基因，它在微生物宿主里表達后可產生一種異種蛋白，該異種蛋白通過宿主細胞的分泌途徑而加工。

本發明的另一個目的是提供在一種微生物宿主里表達異種基因的方法，產生一個由該基因編碼并由該宿主細胞的分泌途徑加工的異種蛋白或其一部分。

本發明的另一個目的是提供一個從一種微生物宿主分泌異種蛋白的生產方法。

本發明進一步的目的是提供一個通過DNA重組技術產生異種蛋白的方法。

本發明另一個目的是提供一個通過DNA重組技術生產具有人胰島素原和胰島素的氨基酸序列的蛋白質。

這些目的和其它一些目的由以下對具體實施方案和權利要求的描述將成為顯而易見。

本發明涉及DNA結構和利用它們的方法，這些結構至少包含有啤酒酵母BAR1基因的信號肽編碼序列，至少一個與宿主生物不同的結構基因，以及在含有BAR1信號肽和該異種蛋白的融合蛋白的宿主生物中控制表達的啟動子。

在附圖中：