[其他]利用負(fù)股核糖核酸引起植物體細(xì)胞的變化

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 86107039
• 申請(qǐng)日: 1986-10-16
• 公開（公告）號(hào): CN86107039A
• 公開（公告）日: 1987-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 弗朗西斯·麥克科米科;肯尼思·A·巴頓;威廉·F·史惠恩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 阿格拉塞特斯
• 主分類號(hào): C12N15/00
• 分類號(hào): C12N15/00;C12N5/00
• 代理公司: 上海專利事務(wù)所
• 代理人: 全永留,夏曉

本發(fā)明涉及把重組DNA技術(shù)應(yīng)用于高等植物的遺傳轉(zhuǎn)化或基因工程。特別是，涉及通過采用負(fù)RNA股引起高等植物體細(xì)胞的變化，以便控制植物的基因表達(dá)或者獲得其他有用的體細(xì)胞效應(yīng)，例如抗病性的方法。

目前人們已經(jīng)能夠在體外組建遺傳物質(zhì)，即DNA的片段，并將這些片段轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中的質(zhì)粒中。同時(shí)也能夠利用克隆了的片段，或在細(xì)菌質(zhì)粒中克隆完整基因，而質(zhì)粒作為載體可把這些片段或者基因攜入其他細(xì)胞。已經(jīng)獲得合適的載體可用于遺傳上轉(zhuǎn)化各個(gè)植物細(xì)胞，從這些細(xì)胞可以再生出完整未損的植物。有文件表明外源的基因可以穩(wěn)定地插入植物細(xì)胞的基因組內(nèi)，從而使完整未損，體細(xì)胞正常并且具有繁殖能力的植物得以重建。K.A.Barton.等。含有基因工程方法獲得的T-DNA的全長(zhǎng)考貝的完整煙草植物的更新，以便將T-DNA傳遞到R₁子代，32細(xì)胞1033（1983年4日）。研宄者們報(bào)導(dǎo)他們已經(jīng)能夠?qū)⑼耆耐庠椿蛞胫参锛?xì)胞并在這些植物細(xì)胞中獲得基因的表達(dá)，同時(shí)知道并且期望這些細(xì)胞能夠被再生為完整未損的植物中。歐洲專利申請(qǐng)S.N.84302582.2號(hào)，1984年4月16日申請(qǐng)（Kemp）;PCT申請(qǐng)?zhí)朩O84/02920/和W084/02913，兩者都于1984年1月16日申請(qǐng)（Fraley）。一般地說(shuō)，插入的基因只有構(gòu)成位于植物系統(tǒng)的合適的基因控制區(qū)域時(shí)才能在植物中起作用。

目前絕大多數(shù)的用于改變植物的基因工程的方法都包括在細(xì)胞水平上利用天然植物轉(zhuǎn)化因素Agrobacterium????tumefaciens，對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行飾變的過程，而該轉(zhuǎn)化因素具有感染雙子葉植物，并將A.tumefaciens的某一部分DNA（稱為T-DNA）轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中去的天然能力。已經(jīng)提出其他的方法，不采用A.tumefaciens，同時(shí)用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物及單子葉植物的個(gè)別細(xì)胞，尤其是原生質(zhì)體。目前許多植物種的基因工程技術(shù)上的主要障礙是，不能順利地從愈傷組織培養(yǎng)物或者原主質(zhì)再生成許多植物種。對(duì)于用目前的技術(shù)可以再生的那些植物種而言，培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化的可導(dǎo)致在完整未損或其他正常植物中完全外源基因的表達(dá)。對(duì)于用目前技術(shù)還不能使之再生的植物種而言，一旦這些技術(shù)被改進(jìn)后，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)于這些完整植物種的有規(guī)則的遺傳轉(zhuǎn)化。

一旦能夠用基因工程方法創(chuàng)造一種植物種，接下來(lái)的問題便是使植物獲得什么樣的合理的遺傳轉(zhuǎn)化以便使植物按照人們意愿變得更加適于農(nóng)業(yè)或園林應(yīng)用。應(yīng)用于植物的基因工程的一個(gè)共同的方法是把外源性的蛋白基因?qū)胫参铮允乖摶蛟谥参镏斜磉_(dá)蛋白質(zhì)，該蛋白可以有一種或者多種的用途，例如抗病性，抗昆蟲性，酶促活性，或可用作食物配料等等。

在此敘述的發(fā)明提供一種基因工程技術(shù)在植物方面的應(yīng)用的替代方法，以便使植物獲得體細(xì)胞的有益的變化，該方法不涉及任何外源蛋白表達(dá)，取而代之，該方法涉及對(duì)于內(nèi)源蛋白表達(dá)的控制或者對(duì)于某一蛋白基因或其他DNA或RNA因子的操縱，該DNA或RNA因子是通過外界因素，如疾病因素或感染因素自然導(dǎo)入植物細(xì)胞的。

以前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到人工組建的負(fù)股RNA將在體內(nèi)與互補(bǔ)的RNA雜交。這一現(xiàn)象已用于研宄在大腸桿菌中基因表達(dá)的有規(guī)律的機(jī)制。Mizuno等，在大腸桿菌K-12中小的RNA轉(zhuǎn)錄本（micRNA）對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，10????Proc.Japan????Acad.59.Ser.B，pp.335-338（1983），Mizuno等，調(diào)節(jié)基因表達(dá)的獨(dú)特機(jī)制：由互補(bǔ)RNA轉(zhuǎn)錄本（micRNA）引起的轉(zhuǎn)錄抑制作用，81????Proc.Natl，Acad.Sci.USA，pp.1966-1970（1984）。

本發(fā)明涉及到對(duì)植物進(jìn)行有用的遺傳轉(zhuǎn)化的方法，該方法使植物本身獲得有用的體細(xì)胞變化，而不特別涉及外源蛋白的表達(dá)。該方法包括把為負(fù)股RNA的轉(zhuǎn)錄而構(gòu)成的DNA順序?qū)胫参锘蚪M，這種負(fù)股RNA基本上是內(nèi)源的或天然引入的RNA股的目標(biāo)的互補(bǔ)，其功能需要加以抑制以便防止內(nèi)源蛋白基因的表達(dá)或者防止自然導(dǎo)入的RNA或DNA的作用，如通過某些類型寄生蟲或疾病感染所發(fā)生的那樣。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用基因工程創(chuàng)造不需要引起外源蛋白的表達(dá)而具有有用的體細(xì)胞特性的植物的方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種總的控制植物中的內(nèi)源基因表達(dá)的方法。

本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點(diǎn)由下面的詳細(xì)說(shuō)明來(lái)表明。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示用于作為本發(fā)明例子之一的起始材料的質(zhì)粒POM5????H2的限制內(nèi)切酶圖。

圖2為煙草花葉病毒的RNA的圖解。