[其他]克隆限制性基因和修飾性基因

無效

• 申請號: 86102277
• 申請日: 1986-03-01
• 公開（公告）號: CN86102277A
• 公開（公告）日: 1986-10-01
• 發明（設計）人: 杰弗里·格雷厄姆·威爾遜
• 申請（專利權）人: 新英格蘭生物實驗室公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 巫肖南

本發明是關于生產各種限制性酶類和/或修飾性酶類的無性系，即生產這些無性系的方法及從這些無性系中生產限制性和/或修飾性酶類的方法。本發明特別涉及到HaeⅡ限制性核酸內切酶和修飾性甲基化酶以及TagⅠ限制性核酸內切酶和修飾性甲基化酶的無性系，還涉及到生產這些無性系和酶類的方法。

限制性核酸內切酶是一種天然地有在于細菌中的酶類，當這些酶從其他污染的細菌成份中純化出來時，可以用于實驗室，把DNA分子切成各種精確的片斷。這種特性能使DNA分子被準確無誤地識別，并被切割成組成它們的各種基因。已證明限制性核酸內切酶是現代遺傳學研究上不可缺少的工具。這種酶類是生物化學的“剪子”，用其來進行遺傳工程和分析。

限制性核酸內切酶是沿著DNA分子在識別和把其連結到特殊的核苷酸序列（‘識別序列’）上時起作用的。一旦結合上，這種酶就在認別序列的內部或一側把這種DNA分子切開。不同的限制性核酸內切酶有對不同識別序列的親和性。在迄今為止調查研究過的成千上石種的細菌中，已鑒定了將近百種不同限制性核酸內切酶。

每一細菌種屬最多只含有少數幾種限制性核酸內切酶。限制性核酸內切酶原則上是根據獲得它們的細菌種的名稱來命名的。例如，埃及嗜血桿菌屬（Haemophilus????aegyptius）合成三種不同的限制性核酸內切酶，被命名為HaeⅠ，HaeⅡ和HaeⅢ。這三種限制性核酸內切酶分別識別和切開（AT）GGCC（AT），Pu????GCGCPy和GGCC序列。另一方面，大腸桿菌Ry13（Escherichia????Coli????Ry13）僅合成一種酶E.CORⅠ，它是識別GAATTC序列的。

實際上，在細菌細胞的繁衍中，限制性核酸內切酶是起著一種保護性作用的。這種酶能使細菌抵抗各種外來DNA分子如能破壞或寄生于它們的病毒和質粒的侵染。這種限制性核酸內切酶通過每時每刻檢查侵染的DNA分子的長度和把存在的識別序列切開來發揮這種抗性的。發生的這種切割使侵染的基因不能發生作用，而且這種DNA變得更容易受到非特異性的核酸外切酶的進一步降解。

細菌保護系統的第二種成份是修飾性甲基化酶類。這類酶是與限制性核酸內切酶相互補的，且提供一種細菌用其就能鑒識它們自己的DNA和區別出外來的侵染DNA的手段。修飾性甲基化酶象相應的限制性核酸內切酶一樣，識別和連結到同一核苷酸識別序列上，但卻不是切開這種DNA，而是在化學上通過附加上一個甲基基團來修飾此序列內的一種或他種核苷酸的。隨著這種甲基化作用后，識別序列就不再與限制性核酸內切酶結合或被其切開了。經過甲基化酸類的修飾作用，細菌細胞中的DNA總是完全修飾，因此對其內源的限制性核酸內切酶的存在是完全不敏感的。只有未領到修飾的因而能被鑒別的外源DNA才對限制性核酸內切酶的識別和攻擊是敏感的。

隨著遺傳工程技術的出現，現在已能夠克隆基因及生產蛋白質和酶類，而且克隆的基因編碼量比用常規提純技術獲得的基因更大。分離各種限制性核酸內切酶無性系的關鍵是要發展一種既簡單又可靠的方法以便當這種無性系發生的頻率像10^-4到10^-3那么低時在復雜“庫”中鑒別這種無性系。所謂“庫”，即用“鳥搶式”實驗方法獲得的那些無性系群體。這種方法最好是具有選擇性，以便使不希望要的大部份無性系破壞掉，而稀少的所期望的無性系存活下來。

一些研究者已利用噬菌體的感染作用作為一種選擇性分離限制性核酸內切酶無性系的手段（Walder等人，Proc.Nat.Acad.Sci，741503-1507頁〔1981〕，Ma N_n等人，Gene 3：97-112頁〔1981〕。既然細菌內的限制性一修飾性系統的存在能使細菌抵抗噬菌體的感染，那么攜帶有克隆的限制性-修飾性基因的細胞，在原則上就可以作為存活者從暴露于噬菌體的各種庫中有選擇地分離出來。然而，已經發現這種方法只有有限的價值。特別是已經發現克隆的限制性-修飾性的基因不總表現出對噬菌體有足夠抗性而能選擇地存活下來的。

因為純化的限制性核酸內切酶和在較少范圍內純化的修飾性甲基化酶，都是供在實驗室中使DNA標志化和使DNA進行重排的有用工具，所以在商業上就鼓勵發展這種能大量合成這些酶類的細菌菌株。這樣的細菌菌株將簡化了提純工作同時提供了在商業上有實用價值的生產手段，所以這種細菌菌株很有用。