[其他]促生長素的溶解和復性方法

無效

• 申請號: 86100915
• 申請日: 1986-02-21
• 公開（公告）號: CN86100915A
• 公開（公告）日: 1986-08-20
• 發明（設計）人: 拉里·安德魯·本特爾;詹姆斯·威廉·米切爾;斯蒂芬·布雷德利·斯托爾斯;格蘭特·強島本
• 申請（專利權）人: 孟山都公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N1/38
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 羅宏

重組DNA技術已使異源蛋白質能在一些宿主細胞如大腸桿菌（E.CoLi）中得以表達，但已有報道指出，有些異源蛋白質，如促生長素，往往在表達后仍不同程度地被封閉于宿主細胞的胞質折射體內。

一些促溶劑，如鹽酸胍、硫氰化鈉、尿素和不同的去污劑，已被用來破壞蛋白質分子內的非共價聯系。例如已有實驗表明，在促溶劑的作用下，蛋白即“展開”，見Stryer，Biochemistry，《生物化學》（1981年第二版）34-35頁，W.H.Freeman和Cempany。同樣地，促溶劑還能使多亞基蛋白質解離，形成其各個亞基。

最近歐洲專利申請114，506A號公布，異源蛋白質能用某種烈性促溶劑如鹽酸胍、去污劑如十二烷基硫酸鈉和硫氰酸鹽從折射體內溶解出來。而尿素這種較弱的促溶劑則對折射體無溶解作用。但鹽酸胍這樣的強變性劑是很昂貴的。此外，異源蛋白質一經溶于強變性劑，還必須把它移入不會干擾以后的離子交換純化步驟的弱變性劑中。

因此，本發明的目的是提供一能從宿主細胞的折射體中溶解出異源促生長素蛋白，并使其復性的改良方法。

提供應用既容易得到，又相對便宜的試劑的方法，是本發明的目的之一。

在相當高的促生長素濃度下進行復性也是本發明的一個目的。

使促生長素蛋白的溶解和/或復性在有或無還原劑存在的情況下都能進行則是本發明的另一目的。

另外，采用一種在生態學意義上較以往所用試劑更為安全的試劑也是本發明的目的。

本發明的所有這些目的和優越性對于那些熟悉以下敘述和例證的人來說將是顯而易見的。

簡言之，本發明提供了一種從宿主細胞的折射體內溶解出促生長素蛋白并使之復性的方法。特別是本方法還包括這樣一個發現，即觀察到一種尿素或二甲砜的水溶液能用來有效地溶解含有促生長素這類蛋白質的折射體。令人驚奇的是，還進一步發現促生長素蛋白一經溶解，在尿素或二甲砜的溶液中與溫和氧化劑接觸的時間足以使蛋白質天然構象中的二硫鍵得以形成，促生長素蛋白即可復性。同時，這種復性過程即使在高蛋白濃度，制品不純甚至不用還原劑的情況下都能高效率地發生。

為了說明本發明的目的，似乎應考慮對一些術語作如下定義：

“促生長素”指包括但并不只限于哺乳動物的促生長素，如人、羊、豬和牛的促生長素，和鳥類的促生長素。除了適用于上述具有天然順序的蛋白質外，本發明同樣適用于一系列與天然存在的蛋白有關，且具有促生長素樣活性的類似物和同源物。對本方面熟悉的人們將明白其它具有促生長素相似化學性質的促生長素類的蛋白，如催乳素和胎盤催乳素，從純化上考慮實際上是與促生長素等同的。有鑒于此本發明亦包括這樣一些蛋白質。

“異源”蛋白質是指宿主細胞正常情況下不產生的蛋白質。重組DNA技術已使大量異源蛋白質在轉化的宿主細胞中得到表達，但尚不十分了解的是，這些蛋白質常會被隔離在宿主細胞胞質的不溶性光折射體中。

“折射體”指這樣的包含體或胞質內凝聚物，它們，至少其中一部分，含有被提取的異源促生長素。這些凝聚物在相差顯微鏡下看上去象一些明亮的斑點。

“宿主細胞”指一種微生物細胞，如細菌和酵母或其他適宜的細胞，如動、植物細胞，它們已被轉化用以表達異源促生長素。宿主細胞在本發明中被看作是那些表達了外源促生長素然后將此激素封閉進折射體的細胞。一種典型的宿主細胞是大腸桿菌（E.CoLi）K₁₂（W3110/PBGH-1株），該細胞已被轉化來表達牛促生長素。

“復性”是指促生長素蛋白折迭和氧化形成具有其生物活性的天然構型。

“折迭”是指蛋白質整體構型的恢復足以使之適當的氧化。折迭是通過降低尿素的變性效應來完成的，如有必要，將尿素濃度調節到一適當水平，從而保證蛋白質中氨基酸的相互作用以呈現其二、三級結構。

“氧化”是指分子內二硫鍵的形成，以獲得穩定的天然構型，從而保證其生物活性。

“溫和氧化劑”指一種促使巰基氧化，使其形成分子內二硫鍵，但不氧化蛋白中其它取代基團的試劑。在采用溫和氧化劑如過氧化氫的同時，暴露于空氣的方法也是完全可接受的并且更為可取。

“生物活性”是指促生長素能夠產生其應產生的體內生理反應。此生物活性能通過已去除內源性促生長素的特定物種的適宜的體內生物測定實驗來鑒定。本發明采用一種適用的促生長素生物測定法，稱之為“大鼠增重生物測定法”。該方法中，促生長素制品的生物活力是相對一已知制品（如提取的天然促生長素）來估價的。系通過比較不同的制品劑量與對去垂體大鼠體重的增長量的關系來確定。