[其他]用鏈球菌發酵制造高分子量透明質酸鈉的方法

無效

• 申請號: 86100913
• 申請日: 1986-01-18
• 公開（公告）號: CN86100913A
• 公開（公告）日: 1986-09-24
• 發明（設計）人: 阿布拉哈姆·尼姆羅德;本詹明·格林曼;多夫·卡納;莫施·蘭德斯伯格
• 申請（專利權）人: 生物工藝總公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/08;A61K31/725;//;C12R146)
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 顧柏棣,辛敏忠

本申請是1985年1月18日提出的美國專利申請號692，692的部分繼續申請，為便于參考該申請的內容編入本申請中。

本發明涉及用鏈球菌屬微生物大規模發酵制造高分子量透明質酸鈉的方法。

透明質是天然存在的由分子量為50，000-13，000，000道爾頓的線性高聚物組成的葡糖聚糖。它是由葡糖醛酸和N-乙酰基-葡糖胺重復單元用1-3和1-4鍵交替鍵合組成的多糖類。

透明質酸存在于各種動物的結締組織中，象表皮和軟骨。一些器官特別富有透明質酸，如臍帶、滑膜液、（眼球的）玻璃體液和雞冠。另外，透明質酸也可由各種微生物，象A型和C型鏈球菌來制取。

在表皮和軟骨內，透明質酸的作用是結合水、保持肌肉的正常張力和組織的彈性。在關節液內，粘性的透明質酸溶液作為潤滑劑，對細胞提供一個保護環境。從雞冠中提取超純的透明質酸溶液作為靜脈注射用營養液，在眼外科中已應用了幾年。見E.A.Balazs的美國專利No.4，141，973（1979）。類似的制劑已表明有利于治療競賽馬的發炎膝關節。透明質酸另一個用途是由于它的高親水性，使之成為用在化妝品中增濕洗劑的理想組分，見E.Balazs的美國專利No.4，303，676（1981）。

如上所述，透明質酸已經從包含細菌培養液的各種生物源中分離出來。下列文獻所述：透明質酸的離析和特性：Meyer等，J.Biol.CHem.107，629（1934）;J.Biol.Chem.114，689（1936），最近在Methods????in????Enzymol.28，73（1972）中已有綜述文章。透明質酸的結構已由Weissman等闡明，J.Am.Chem.Soc.76，1753（1954）;Meyer，Fed.Proc.17，1075（1958）。

用鏈球菌制造透明質酸最先由Forrest等發表在J.Biol.Chem.118，61（1937），各研究者進一步詳述有：Roseman等，J.Biol.Chem.203，213（1953），Pierce和White，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.87，50（1954），G.H.Warren的美國專利No.2，975，104（1961）和Sunghara等，J.Biol.Chem.254，6252（1979），論證來源于動物和微生物的透明質酸的本性。以小型至中型規模對A型鏈球菌的分批發酵以及對透明質酸的分離，已經公布的程序有：Thonard等J.Biol.Chem.239，726（1964）;Holmstrom和Ricica，Appl.Microbio.15，1409（1967）;Kjems和Lebech，Acta????Path.Microbiol.Scand.84，162（1976）。這些過程包括病原菌的厭氧發酵，得到分子量等于或小于700，000的透明質酸，其收率為0.4-1克/升。

其它生產過程涉及鏈球菌喜氧發酵生產透明質酸，如日本公開專利No.58-056692，公布于1983年4月4日，發明者Akasaka????H，等。其它文獻E.A.Balazs的美國專利No.4，141，973，1979年2月27日，涉及以動物結締組織為來源制造和提純透明質酸。但是在先有技術公開的透明質酸的制造和純化的過程，未能產出平均分子量大于2.0×10⁶道爾頓的透明質酸。這在很大程度上是由于在透明質酸組合物中存在的金屬離子或雜質能催化反應中的剪切或氧化而促使透明質酸降解。

此處描述的分子量從約1×10⁶到約4.0×10⁶道爾頓的制造透明質酸的新工藝，厭氧發酵，產量約2克/升;喜氧發酵，產量約4-6克/升。這一點由于產生鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）的C型突變菌株HA-116，ATCC39920而成為可能。該菌株是透明質酸的高產者，而且溶血素陰性，即很小的致病性。動物流行性鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus），HA-116，ATCC 39920的喜氧發酵以及隨后的透明質酸鹽的純化實現了平均分子量大于3.5×10⁶道爾頓透明質酸鈉的（分批）生產。本發明是第一個用細菌發酵生產和純化高分子量透明質酸鈉的方法。無致熱性和無刺激性的透明質酸鈉可以采用本發明提供的方法制取。

其他屬于本發明范圍的方法，也可用于制造超純的，適合在臨床應用的非炎癥性透明質酸。