[其他]逆向斑點分子雜交技術

無效

• 申請號: 85109606
• 申請日: 1985-12-05
• 公開（公告）號: CN85109606A
• 公開（公告）日: 1987-06-17
• 發明（設計）人: 陳淵卿;顧健人
• 申請（專利權）人: 上海市腫瘤研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12N15/00;G01N33/576
• 代理公司: 上海專利事務所
• 代理人: 吳淑芬

本發明涉及一項新的分子雜交技術，特別是逆向斑點分子雜交技術，更為具體地是涉及人體乙肝病毒的一種新的檢測方法。

乙型病毒性肝炎的病原體乙肝病毒（HBV）是一種引起人體肝炎的脫氧核糖核酸（DNA）的病毒。據統計，目前全世界已有二億多人受到乙肝病毒的感染，大量流行病學資料表明，它的感染與人體原發性肝癌的發生密切相關。

HBV的完整病毒為：含有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的外殼包裹和乙型肝炎核心抗原（HBc????Ag）、病毒基因組-DNA與該病毒的脫氧核糖核酸聚合酶（DNA聚合酶）構成的核心，它又稱為Dane顆粒。其平均直徑為42毫微米。由于表面抗原（HBs????Ag）基因在肝細胞內過量表達，因而在乙肝攜帶者血清內還可發現平均直徑為22毫微米的表面抗原顆粒，由于它并不含有該病毒的基因組DNA及其DNA聚合酶，因而這種顆粒無致病性。在已有技術中，已發展了以下幾種檢測乙型肝炎病毒感染的方法：

1.利用免疫血清學方法測定乙型肝炎兩對半抗原及相應的抗體標志，包括乙型肝炎表面抗原（HBs????Ag）及其抗體（抗HBs）、e抗原（HBe????Ag）及其抗體（抗HBe）以及乙型肝炎核心抗原的核體（抗HBc）。這是目前臨床應用的常規方法。由于e抗原在一定程度上代表了核心抗原的存在，因而它的存在對判定乙肝感染性有一定的臨床意義。然而，上述兩對半標志物，包括e抗原本身并不直接涉及乙肝病毒復制、增殖，因而它們只能是乙型肝炎病毒感染的間接標志。

2.HBV DNA斑試測定，這是近年來發展的一項新技術。其優點是直接測定HBV的病毒基因組，因而是一項測定乙型肝炎感染性的直接標志。但這一方法測定的結果，尚不能排除血清中可能存在游離的HBV DNA片段，它們可能是降價的HBV DNA，同時由于無病毒的外殼及該病毒的聚合酶，因而無感染能力。同時，該方法測定時，首先必須經遺傳工程方法擴增含HBV DNA順序的重組質粒，然后，再把它的載體DNA切除，上述純化物的HBV DNA應用制品翻譯（Nick-trans Iation）的方法制得^3eP-HBV DNA探針對血清樣品進行斑試測定，因而方法較繁復，成本較高。

3.HBV DNA聚合酶的測定。早在1973年，凱普萊恩（Kaplan）等應用氚標記-三磷酸脫氧胸苷（³H-TTP）及其他三個DNA合成的前生物三磷酸脫氧腺苷、三磷酸脫氧鳥苷和三磷酸脫氧胞苷（dATP、dCTP、dGTP）滲入的方法測定HBV內源的DNA聚合酶，對于HBV DNA聚合酶的測定，反應了復制型的病毒的存在，因而為乙型肝炎的檢測提供了直接標志。但該方法僅通過三氯醋酸（TCA）沉淀法測定³H-TTP滲入后的DNA產物的放射強度，經過與幾個同時測定的正常血樣³H-滲入后的平均值進行數理統計來判定其聚合酶的活力。雖然近年來此方法已有不少改進，如采用三氯醋酸的紙層析來代替三氯醋酸直接沉淀法以減少³H-TTP的污染等，但由于方法頗為復雜，同時又無法排除血清中可能存在的其他病毒如EBV等DNA聚合酶的干擾，因而仍不能成為特異地確定乙型肝炎病毒感染性的理想標志。

本發明的目的在于克服上述各種乙型肝炎病毒感染檢測方法所存在的缺點，提供一種簡便的檢測方法，確定乙肝病毒感染性的直接而可靠的標志，這種方法便是我們在國際上首創的逆向斑點分子雜交技術。