[其他]逆向斑點分子雜交技術

無效

• 申請號: 85109606
• 申請日: 1985-12-05
• 公開（公告）號: CN85109606A
• 公開（公告）日: 1987-06-17
• 發明（設計）人: 陳淵卿;顧健人
• 申請（專利權）人: 上海市腫瘤研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12N15/00;G01N33/576
• 代理公司: 上海專利事務所
• 代理人: 吳淑芬

1、一種逆向斑點分子雜交的檢測方法，包括以下步驟

對含有完整HBV?DHA順序的重組質粒作變性處理；

將所述經變性處理的重組質粒放入冰溶中速冷；

在所述速冷后的重組質粒內加入氫氧化鈉使后者的濃度為0.2-0.50克分子；

將所述的氫氧化鈉溶液點樣于硝基纖維濾膜，并使之干燥；

將所述點樣后的濾膜用緩沖系統浸泡中和，并使之干燥；

將所述干燥后的濾膜放入預雜交液中進行預雜交；

將受撿血清加入非離子去垢劑及聚合酶保護劑；

將所述血清再加入包含緩沖系統及四種DHA合成的前生物三磷酸脫氧核苷、其中至少有一種帶有可顯示的標記物的反應混合液、進行培育、制成含標記物的HBV?DHA分子探針；

將所述含標記物的HBV?DHA分子探針加入雜交混合液，作變性處理，制成單鏈的含標記物的HBV?DHA分子探針；

將所述的單鏈含標記物的HBV?DHA分子探針放入冰浴中速冷；

將所述速冷后的單鏈的含標記物的分子探針與上述經預雜交液雜交處理的硝基纖維雜交濾膜雜交，并用洗脫液洗去未雜交的游離的標記物；

將所述雜交后的硝基纖維雜交濾膜干燥后，通過標記物顯示的方法來判定受撿血清中感染性的HBV的存在。

2、按權利要求1所述的方法，其中，所述的反應混合液中所述的可顯示的標記物是放射性同位素，并且，上述使標記物顯示的方法是采用使X-線感光片作放射性自顯影的方法。

3、按權利要求1的方法，其中，所述的反應混合液中所述的可顯示的標記物是生物素（Biotin），并且，上述使標記物顯示的方法是采用生物素與抗生物素蛋白（AVidine）特異結合，通過酶標法（ELISA）、抗抗生物素抗體的螢光免疫法或放射免疫法顯示。

4、按權利要求2的方法，其中，所述的放射性同位素是³²-P、¹²⁵I-或³⁵S-的dNTP。

5、按權利要求1的方法，其中，所述的緩沖系統由中性緩沖液、氯化鎂和氯化銨組成。

6、按權利要求5的方法，其中，所述的中性緩沖液是三羥甲基氨基甲烷、磷酸、硼酸或其他常規中性緩沖液。

7、按權利要求1所述的方法，其中所述的反應混合液溫度為37℃，作用時間為2-5小時。

8、按權利要求1所述的方法，其中，所述的預雜交由0.2%牛血清白蛋白，0.2%聚乙烯基吡咯烷酮液0.2%聚蔗糖、0.9克分子濃度氯化鈉及0.09克分子濃度檸檬酸鈉組成。

9、按權利要求1的方法，其中，所述的預雜交溫度為43℃，預雜交時間為4-24小時。

10、按權利要求1的方法，其中，所述的雜交混合液包括30-60%甲酰胺、0.3克分子濃度氯化鈉、0.03克分子濃度檸檬酸鈉、0.2%焦磷酸鈉、0.02%牛血清白蛋白、0.02%聚蔗糖、0.02%聚乙烯吡咯烷酮及100微克/毫升魚精DHA。

11、按權利要求10的方法，其中，所述的雜交混合液還包括右旋糖苷硫酸酯。

12、按權利要求1的方法，其中，參入含標記的HBV??DHA分子探針的雜交混合液變性處理溫度為100℃，作用時間為5-10分鐘。

13、按權利要求10的方法，其中，所述的魚精DHA是經超聲斷鏈及100℃變性的單鏈魚精DHA。

14、按權利要求1的方法，其中，所述的單鏈含標記物的HBV??DHA分子探針與所述經預雜交液雜交處理的硝基纖維雜交濾膜雜交的溫度隨雜交混合液中甲酰胺濃度的改變而改變，在甲酰胺濃度為50%時，雜交溫度為43℃，雜交時間為18-36小時。

15、按權利要求1的方法，其中，所述的洗脫液先后采用0.3克分子濃度氯化鈉和0.03克分子濃度檸檬酸鈉組成的洗脫液以及0.3克分子濃度氯化鈉、0.03克分子濃度檸檬酸鈉和0.1%十二烷基硫酸鈉組成的洗脫液。