[其他]細菌多糖與免疫原蛋白共價結合物的制備方法

無效

• 申請號: 85104164
• 申請日: 1985-05-31
• 公開（公告）號: CN85104164A
• 公開（公告）日: 1987-02-04
• 發明（設計）人: 斯蒂芬·馬伯格;彼得·J·尼斯克恩;理查德·L·托爾曼
• 申請（專利權）人: 麥克有限公司
• 主分類號: C07K9/00
• 分類號: C07K9/00;A61K39/02
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 辛敏忠,顧柏棣

本發明的內容是關于共價修飾的細菌多糖和免疫原性蛋白質，由一個雙屬間隔基連接的這種多糖的共價結合物，它有利證明其共價性和生物學上所希望的具有免疫原性的細菌膜或其它蛋白質實體的純化和濃縮，這些結合物是細菌疫苗的有用成分。本發明亦與這些多糖、蛋白質和結合物的制備方法以及證實多糖和蛋白質之間結合物連接的共價性的方法有關。

純化的細菌莢膜多糖已被用于制備抗同族細菌的疫苗，但免疫應答的結果常常不像所希望的那樣滿意，特別是幼兒和免疫系統不成熟或不健全者。如流感嗜血桿菌B型莢膜多糖不能引起嬰兒的免疫應答。因此制備這種多糖本身不能保護小兒抵抗由該桿菌所致的嚴重小兒醫療問題。將其與蛋白質結合?？稍黾冞@些多糖的免疫原性。如可參看Schneerson????et????al.，“Haemophilus????Influenjae????Type????b????Polsaccharide-Profein????C????onjugates：Model????for????a????New????Generation????of????Capsular????Polysac????charid????Uaccines，”New????Dev.with????Hum.d????Vet.Vaccines，77-94（1980）;Schneerson，et????al.，J.Exptl.Med.，152，361（1980）.，和Anderson，Infection????and????Immu????nity，39，233（1983）。

但必須細心選擇與這些多糖結合的蛋白質，某些蛋白質（Pertussinogen）是嬰兒免疫系統的非特異性刺激劑。在一定程度上這些蛋白質增強對多糖抗原的免疫應答。但不幸的是這種非特異性激活作用導致一些所不希望的生物學效應（即反應原性）。通過將這些多糖結合到適當蛋白質上如首先由W.F.Goebl和O.T.Avery在1929年所報告的那樣能使嬰兒增強對這些抗原的很多好的特異性免疫應答（J.Exptl.Medicine????50，521-531（1929））。

多糖與蛋白質結合的方法亦必須細心考慮，假如如所相信的那樣，免疫增強是多糖決定簇向蛋白質載體決定簇分子接近的結果，那么這些部位在生物系統中是不易分離開的。由多糖的多陰離子特性和載體蛋白質的陽離子特性所產生的非共價復合物可以刺激免疫應答，但這些復合物是化學上不穩定的，其免疫應答看來是非T細胞依賴的。相反，多糖和蛋白質的共價結合物具有強得多的化學穩定性而且能證明是T細胞依賴的免疫應答。

多糖-蛋白質共價結合物文獻中已有所述，但共價連接的精確性質尚未被證明或被定量，因為對于共價性的唯一分析方法是在體內的活性，而文獻中所描述的程序難以重復出來。流感嗜血桿菌b型，肺炎鏈球菌6A型多糖先與溴化氰反應，后與脂肪酸二酰肼反應，最后與破傷風類毒素或鱟蟹血藍蛋白質結合（Schneerson????al.J.Exptl.Med.，152，361（1980）和Infe????ction????and????Immunity，40，245（1983）。肺炎球菌19F型多糖通過從多糖還原端和蛋白質側胺基（即賴氨酸）形成亞胺（Schiff堿基）而直接結合到牛血清蛋白上，然后用氰硼氫化鈉還原這些亞胺（Lin????et????al.，Immunolo????gy，46，333（1982））。

另外，連接到重氮化芳香胺上的多糖結合到蛋白質的酪氨酸上（K.K.Nixdorff????et????al.，Immunology????29，87（1975）），連接到芳香胺的多糖轉換到異硫氰酸鹽上，然后連接到蛋白質的賴氨酸側氨基上（S.B.Svenson????and????A.A，Lindherg，j.Immunolog.Methods????25，323（1979））。但上述任何一種方法所產生的結合物都僅僅是憑其凝膠滲透層析特性鑒定的。在另一個例子中（S.Nutani????et????al.，Infection????and????Immunity????36，971（1982）），多糖，出芽短梗孢糖（Pullulan）用氰尿酰氯（Cyanuric????chloride）活化，然后與破傷風類毒素反應。此法所生成的結合物以電泳法而且僅僅表明是不同于開始的物質而鑒定的。

除了用推斷聚合分子量以外，這些方法中沒有一個能證明其共價性，因此將與分子復合物中多陰離子和多陽離子的相互作用的共價性相混淆，因為這些復合物亦將給出一聚合分子量。