[其他]生產高增溶蛋白的方法

無效

• 申請號: 85101554
• 申請日: 1985-04-01
• 公開（公告）號: CN85101554A
• 公開（公告）日: 1986-07-09
• 發明（設計）人: 奈良潔;本多進
• 申請（專利權）人: 武田藥品工業株式會社
• 主分類號: C07K15/26
• 分類號: C07K15/26;C12N15/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 陶令靄

本發明闡述高增溶蛋白及其生產。

更具體地說，本發明述及人體γ-干擾素高濃水溶液。

干擾素（下面有時縮寫為IFN）是由高級動物細胞經過病毒、核酸等刺激作用而誘導產生的蛋白。在它們的性質中，具有抗病毒、抗癌活性。

眾所周知，人體干擾素按其特性有三種不同的類型，即：α、β、γ型干擾素。

對α型干擾素（下面縮寫為IFN-α）和β型干擾素（下面縮寫為IFN-β）已進行過相當廣泛的研究。因此，已經開發出提純它們的方法，并對它們的性質也了解得相當多。

γ型干擾素（下面有時縮寫為IFN-γ）是由可免疫細胞在淋巴細胞能發生胞芽轉形變異或產生淋巴細胞活素的環境中產生的。因此，它也叫做免疫干擾素。

IFN-γ與IFN-α、IFN-β相比，則有較高的抗增生或抗癌活性，予計會有較廣泛的臨床應用。然而，由于各種各樣的局限性（例如生產上需要新鮮的淋巴細胞），曾建立的生產系統也是效率不高的。另外，有證據說明，不同的細胞形式可以產生不同的IFN-γ分子形式，其結構和性質在當前還是未知的。

本發明的目的在于研究利用遺傳工程技術所生產的人體IFN-γ的提純工藝。在研究過程中，發現人體IFN-γ具有強的聚合傾向性，其提純顯得很困難。為了減少這種傾向性，已研究出生產單節顯性人體IFN-γ的方法。該方法包括在還原硫化物和蛋白變性劑存在下進行凝膠過濾的過程（美國專利，申請號為654，789）。由上述方法制得的單節顯性人體IFN-γ水溶液含有還原硫化物和蛋白變性劑。其中低分子化合物，特別是蛋白變性劑應該除掉，因為它不能用在藥物生產上。但是，在除掉蛋白變性劑后所得到的水溶液之中的人體IFN-γ，其溶解度低，而且在用濃縮或其它方法處理時，能夠沉淀出來。利用本發明方法可生產出人體IFN-γ的高濃水溶液，以及在該溶液中高增溶的人體IFN-γ。

本發明提供了人體γ-干擾素高濃水溶液的生產方法，它包括：從含有蛋白變性劑的人體γ-干擾素的稀釋水溶液中脫除蛋白變性劑;所得到的溶液就地老化;然后進行濃縮。本發明還提供一種含有非共價的γ-干擾素二聚物的人體γ-干擾素水溶液。

作為上述的含有蛋白變性劑的人體IFN-γ的水溶液，最好使用一種將粗IFN-γ在還原硫化物和蛋白變性劑同時存在下進行凝膠過濾所得到的人體IFN-γ水溶液。

所提及的用上述方法欲提純的粗IFN-γ，可以是任何一種含有人體IFN-γ的材料。例如，可以使用由濃縮自然界存在的人體IFN-γ所得到的粗產品，即天然IFN-γ（nIFN-γ）;可以使用由培養法進行培養能產生IFN-γ的微生物（用基因控制_＊技術制取的）所得到的含有人體IFN-γ的材料，即復合IFN-γ（rIFN-γ）〔參見：歐洲專利說明書No.0，089，676;核酸研究，10，2，487-2，501（1982）;自然，295，503-508（1982）;核酸研究，10，3605-3615（1982）〕。更具體地說，上述的IFN-γ包括＊原文為mainpulation，疑誤;可能為manipulation諸如由146種氨基酸（如圖5所示的結果）所組成的多肽和各種不同的多肽碎片，例如：N端基部分一缺陷形式，即多肽的N端基部分缺少不多于四個的氨基酸;C端基部分一缺陷形式，即在整個多肽或N端部分一缺陷形式的不早于第131氨基酸的殘基位置上被斷開。因此，rIFN-γ包括被絲氨酸或蘇氨酸取代的多肽之多肽半胱氨酸殘基。

其中最好的是如圖5所示的由146種氨基酸組成的多肽和多肽〔脫-（C¹_ys-T²_yr-C³_ys）IFN-γ〕的C¹_ys-T²_yr-C³_ys-缺陷形式。

例如，將單節顯性狀態的IFN-γ溶液用緩沖劑稀釋到濃度為30-200微克/毫升，精心操作，不會導致聚集或沉淀，從而得到稀釋水溶液。也可以使用不會引起聚集或沉淀的其它方法。因為單獨使用PH為5.0-8.0的緩沖劑進行稀釋時，通常是直接生成白色沉淀，所以在稀釋時最好使用含有蛋白變性劑濃度為0.5-4摩爾的緩沖劑，由此能夠得到沒有聚集或沉淀傾向的稀釋溶液。當IFN-γ含有半膀氨酸殘基時，上述的緩沖劑還可以含有還原硫化物。