[發明專利]檢測mRNA樣品加帽率的探針、試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 202310852567.0
• 申請日: 2023-07-12
• 公開（公告）號: CN116590382A
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 邵熙;夏梅玲;胡偉;杜青青;肖志華
• 申請（專利權）人: 上海奧浦邁生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中

本發明涉及生物技術領域，具體涉及檢測mRNA樣品加帽率的探針、試劑盒及其使用方法；試劑盒中包括探針，具體探針設計形式為，RNA片段0?50nt+DNA片段1?10nt+RNA片段0?50nt，對DNA片段上的一個或多個堿基進行硒取代；所述探針的DNA片段上未被硒代的部分受RNase?H快切酶特異性切割；利用本發明的試劑盒能夠檢測不同長度mRNA的加帽率，結果準確穩定，保留時間及加帽率結果RSD1%。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種檢測mRNA樣品加帽率的探針、試劑盒及其使用方法。

背景技術

帽子結構是mRNA在體內發揮生物學功能所必不可少的元件。簡單來說，mRNA帽子結構有2個最主要的功能：第一，在細胞中招募蛋白翻譯機器，使得mRNA翻譯表達出執行特定生物學功能的蛋白質；第二，提升mRNA穩定性，避免被細胞內的核酸內切酶降解。既然帽子結構有著如此重要的功能，那么檢測mRNA加帽率毫無疑問成為mRNA生產工藝質量分析里面最關鍵的指標之一。

mRNA分子質量一般成百上千KDa，帽子結構只有500?Da左右。極小的帽子結構在巨大的mRNA分子面前，顯得微不可辨，這就導致加帽mRNA和未加帽mRNA之間的差異極其細微，也就是一個核苷酸或者甲基的區別，常規分離分析方法難以捕捉到。mRNA加帽率檢測的研究者一開始就意識到這個問題，因此，他們通過酶法降解或者切割的方式使得分子質量巨大的mRNA分子變為可分析的同位素標記單核苷酸或者5'末端短序列，比如，RNase?T2，RNase?H，Ribozyme等。搭配焦磷酸水解酶（TAP或者RppH），還可實現帽子方向的檢測。研究者利用聚丙烯酰胺凝膠電泳，毛細管凝膠電泳或者LC-MS系統區分并且定量攜帶帽子的短片段，從而最終確定mRNA加帽率。

RNase?H?是一種核酸內切酶，能夠移除DNA復制過程中片段上面的RNA引物或者加工處理R-Loops，調節R-Loops介導的生物學過程，比如基因表達，DNA復制以及DNA或者組蛋白修飾。在體外，研究報道大腸桿菌RNase?H可以利用DNA-RNA嵌合結構在單鏈RNA特定位點進行切割。然而，RNase?H切割位點存在1個或者多個，導致產生的5'末端短切割片段是異質化的，相互之間存在1個或者幾個核苷酸的差異。

而液相色譜質譜法可以將不同樣本流出物的組成和含量變化轉變為質譜信號，通過質譜儀器測定，從而實現定性定量，以此來表征mRNA的產品純度和完整性。但是該方法對樣本量要求很高，且容易產生離子加和峰，同時液相色譜質譜法對mRNA檢測還存在結果不穩定的現象，體現為色譜峰保留時間不重復和加帽率結果變化較大。

發明內容

為了解決現有技術的不足，解決現有液相色譜質譜法容易產生離子加和峰，且對RNase?H快切酶切割得到的mRNA片段進行加帽率檢測結果不穩定，樣品消耗大的問題，本發明公開了以下方案：

本發明第一個方面公開一種定制化探針，具體定制化探針設計形式為，RNA片段0-50nt+DNA片段1-10nt+RNA片段0-50nt，對DNA片段上的一個或多個堿基進行硒取代；硒取代具體是指脫氧核酸上磷酸根中的氧原子被硒原子取代。定制化探針與待測mRNA的5’端的特異區段反向互補；所述定制化探針的DNA片段上未被硒代的部分受RNase?H快切酶特異性切割。

優選地，所述探針設計形式為RNA片段0-50nt+DNA片段2-10nt+RNA片段0-50nt。

其中DNA片段還可以選自3、4、5、6、7、8、9nt中的任一長度。

優選地，所述定制化探針設計形式為，RNA片段10nt+DNA片段6nt+RNA片段10nt，對DNA片段上的一個或多個堿基進行硒取代。

硒取代后，酶切的可能性降低，會導致酶切更傾向于在只有第四位未取代的DNA處，即提高了酶切特異性。這類設計，可以使之前只有不到50%的酶切特異性提升至90%以上。