[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的熒光探針及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310830021.5
• 申請(qǐng)日: 2023-07-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116656781A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 舒暢;胡鵬輝;黃銳艷;詹玉娟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6816;C12Q1/6876;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 劉紅陽(yáng)

1.一種用于檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針包括MNPs-SSB分散液和RQDs-CP分散液，所述MNPs-SSB由磁球和修飾在磁球上的單鏈DNA結(jié)合蛋白構(gòu)成；所述RQDs-CP由紅色熒光量子點(diǎn)和修飾在紅色熒光量子點(diǎn)上的單鏈DNA構(gòu)成；所述單鏈DNA的序列與待測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的序列互補(bǔ)，所述單鏈DNA結(jié)合蛋白可特異性結(jié)合所述單鏈DNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的熒光探針，其特征在于，所述紅色熒光量子點(diǎn)為CdTe@ZnS熒光量子點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的熒光探針，其特征在于，所述CdTe@ZnS熒光量子點(diǎn)由以下步驟制備所得：

(1)鎘源和還原型谷胱甘肽加溶劑溶解，獲得鎘前體溶液；

(2)鋅源和還原型谷胱甘肽加溶劑溶解，獲得鋅前體溶液；

(3)NaHTe溶液注入鎘前體溶液中，回流一段時(shí)間，在反應(yīng)沸騰狀態(tài)下，注入鋅前體溶液，繼續(xù)回流一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束，得到CdTe@ZnS熒光量子點(diǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的熒光探針，其特征在于，所述RQDs-CP由以下步驟制備所得：

(1)CdTe@ZnS熒光量子點(diǎn)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和單鏈DNA結(jié)合蛋白在緩沖溶液中反應(yīng)一段時(shí)間；

(2)反應(yīng)結(jié)束后，收集紅色沉淀，即為RQDs-CP。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的熒光探針，其特征在于，所述反義寡核苷酸類(lèi)藥物為諾西那生鈉，所述單鏈DNA序列如下:5’-H₂N-(CH₂)₆-CCA?GCA?TTATGA?AAG?TGA-3’

所述單鏈DNA結(jié)合蛋白為T(mén)4?Gene?32Protein。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的熒光探針，其特征在于，所述MNPs-SSB由以下步驟制備所得：

(1)羧基化磁性納米顆粒洗滌后，分散于偶聯(lián)緩沖液中，得到羧基化磁性納米顆粒分散液；

(2)所述羧基化磁性納米顆粒分散液與1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和單鏈結(jié)合蛋白混合，室溫反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行磁分離，所得產(chǎn)物即為MNPs-SSB。

7.一種利用根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的熒光探針檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)若干份RQDs-CP分散液中分別加入梯度濃度的反義寡核苷酸類(lèi)藥物，孵育一段時(shí)間后，加入MNPs-SSB分散液，繼續(xù)孵育一段時(shí)間；孵育結(jié)束后進(jìn)行磁分離，得到若干份上清溶液；

(2)分別測(cè)定若干份上清溶液的熒光強(qiáng)度，得到反義寡核苷酸類(lèi)藥物濃度與對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

(3)RQDs-CP分散液中加入待測(cè)樣品，孵育一段時(shí)間后，加入MNPs-SSB分散液，繼續(xù)孵育一段時(shí)間；孵育結(jié)束后進(jìn)行磁分離，得到上清溶液；

其中，步驟(3)中的RQDs-CP分散液濃度、MNPs-SSB分散液濃度、孵育條件與步驟(1)保持一致；

(4)測(cè)定步驟(3)中上清溶液的熒光強(qiáng)度，并與步驟(2)中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比對(duì)，得到待測(cè)樣品中反義寡核苷酸類(lèi)藥物的濃度。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(3)中，RQDs-CP分散液中RQDs-CP的濃度為0.1～0.8mg/mL。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(3)中，RQDs-CP分散液與反義寡核苷酸類(lèi)藥物或待測(cè)樣品的孵育溫度為25～37℃。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)反義寡核苷酸類(lèi)藥物的方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(3)中，步驟(2)和步驟(4)中使用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，測(cè)定條件為：在610nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，熒光光譜掃描范圍500～700nm，激發(fā)波長(zhǎng)為365nm。