[發(fā)明專利]一種糞便核酸提取預處理液、預處理方法、試劑盒與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310772947.3
• 申請日: 2023-06-27
• 公開（公告）號: CN116574784A
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發(fā)明（設計）人: 蘇雨來;田仁鵬;吳成貢;劉思明;竇文祥
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳生科原生物有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10
• 代理公司: 深圳維啟專利代理有限公司 44827
• 代理人: 邢曉葉

本申請公開了一種糞便核酸提取預處理液、預處理方法、試劑盒與應用，所述一種糞便核酸提取預處理液包括預處理液A和預處理液B；所述預處理液A包括NaHCO₃和/或Na₂CO₃、鹽酸胍和/或異硫氰酸胍以及非離子表面活性劑；所述預處理液B包括Al³⁺和/或Fe³⁺絮凝劑、pH調(diào)節(jié)劑，同時，本申請還公開了一種糞便核酸提取的預處理方法和一種糞便核酸提取試劑盒。本申請的優(yōu)點在于，所述一種糞便核酸提取預處理液具有提取純度高，提取速度快，成本低，提取過程中不會產(chǎn)生氣溶膠污染，不會破壞ddPCR液滴的優(yōu)勢，所述核酸提取試劑盒具有提取耗時短，產(chǎn)物純度高，操作簡便，可用于ddPCR檢測等優(yōu)勢。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種糞便核酸提取預處理液、預處理方法、試劑盒與應用。

背景技術(shù)

目前糞便核酸提取主要有離心取上清水煮法、研磨+柱提法、蛋白酶K+磁珠法等方法。其中，離心取上清水煮法存在檢測精確度不高的現(xiàn)象，其原因在于，在使用離心取上清水煮法進行核酸提取時，細菌及細胞離心后大部分都被沉淀，上清液含量較少；并且此方法需要加熱，容易導致氣溶膠污染，存在提取產(chǎn)物中PCR抑制物質(zhì)較多，所提取的核酸純度不高，并且易出現(xiàn)假陰性漏檢等情況，從而影響整個檢測的準確性和靈敏性；

研磨+柱提法存在提取時間長，操作過程復雜，成本較高，費時費力等情況；

蛋白酶K+磁珠法存在提取時間長，并且提取時需要蛋白酶K，并且此方法需要對樣本進行加熱，容易導致氣溶膠污染；存在提取產(chǎn)物中PCR抑制物質(zhì)較多，導致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性和漏檢，從而影響整個檢測的準確性和靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述至少一種技術(shù)問題，開發(fā)一種提取純度高、成本低、操作簡單、耗時短、可直接應用ddPCR檢測的核酸提取方法，本申請?zhí)峁┮环N糞便核酸提取預處理液、預處理方法、試劑盒與應用。

第一方面，本申請?zhí)峁┮环N糞便核酸提取預處理液，所述預處理液包括預處理液A和預處理液B；

所述預處理液A包括NaHCO₃和/或Na₂CO₃、鹽酸胍和/或異硫氰酸胍以及非離子表面活性劑；其中，所述NaHCO₃和/或Na₂CO₃質(zhì)量分數(shù)為1～10％，所述鹽酸胍和/或異硫氰酸胍濃度為0.2～8.0mol/L；所述預處理液A的pH值為7.0～12.0；

所述預處理液B包括Al³⁺和/或Fe³⁺絮凝劑和pH調(diào)節(jié)劑；其中，所述Al³⁺和/或Fe³⁺絮凝劑質(zhì)量分數(shù)為1％～10％；所述預處理液B的pH值為3.0～7.0。

通過采用上述技術(shù)方案，本申請解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的核酸純度不高、核酸提取操作復雜、耗時長等問題。其機理在于，所述鹽酸胍和/或異硫氰酸胍對糞便樣本細胞進行破裂、抑制核酸酶的活性、保護核酸不被降解；所述非離子表面活性劑能夠輔助細胞的裂解，從而提高細胞裂解效率；所述Al³⁺和/或Fe³⁺絮凝劑與預處理液A中的NaHCO₃和/或Na₂CO₃水解出的OH-在堿性環(huán)境下，會生成Al(OH)₃沉淀，在沉淀的生成過程中會與糞便樣本中的顆粒進行電中和脫穩(wěn)、壓縮雙電層，具有吸附架橋或粘附卷掃和沉淀物網(wǎng)捕等作用，從而生成粗大絮凝體，沉淀PCR抑制物質(zhì)。

因此，本申請?zhí)峁┑募S便核酸提取預處理液在對糞便樣本進行預處理時，不需要酶的加入就可實現(xiàn)對糞便樣本的預處理，并且，本申請?zhí)峁┑募S便核酸提取預處理液，不僅具有能夠徹底處理糞便中雜質(zhì)的優(yōu)點，同時具備所提取的核酸純度高、預處理所需時間較短等優(yōu)勢。

可選的，所述預處理液A還包括EDTA-2Na以及聚乙烯吡咯烷酮K30和/或聚乙烯吡咯烷酮K90；