[發(fā)明專利]柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310709620.1
• 申請(qǐng)日: 2023-06-15
• 公開（公告）號(hào): CN116536390A
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張潤(rùn)慧;楊雪儷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南民族大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/18
• 分類號(hào): C12Q1/18;C12N1/10;C12R1/90
• 代理公司: 北京和聯(lián)順知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11621
• 代理人: 夏偉恒

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法。針對(duì)目前對(duì)柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的鑒定只有體內(nèi)方法，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，效率低下等問題，本發(fā)明提供了一種雞柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法，通過分離鑒定養(yǎng)殖場(chǎng)的柔嫩艾美耳球蟲，制備柔嫩艾美耳球蟲子孢子，采用MDBK細(xì)胞復(fù)蘇、傳代和毒性檢測(cè)，確定藥物最小抗球蟲濃度，在最小抗球蟲濃度的藥物下進(jìn)行繁殖抑制實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)繁殖抑制率并評(píng)價(jià)耐藥性等步驟。本發(fā)明的體外鑒定雞柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的方法尚屬首創(chuàng)，該方法不僅建立了球蟲子孢子的制備方法，還確定了體外耐藥性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，該方法簡(jiǎn)單高效，安全可靠，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法。

背景技術(shù)

雞球蟲病是由頂復(fù)門原蟲艾美耳屬球蟲(Eimeria)寄生于雞腸道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)所引起的一種寄生性原蟲病，對(duì)全球的養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。至今，我國(guó)公認(rèn)的雞艾美耳球蟲有7種，其中以柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)致病性最強(qiáng)，危害最為嚴(yán)重。在養(yǎng)雞生產(chǎn)中，由于球蟲疫苗使用效果的穩(wěn)定性差、存在弱毒返祖等原因，目前藥物防控仍然是控制雞球蟲病的主要措施，但是現(xiàn)有的藥物由于耐藥蟲株的產(chǎn)生，面臨治療效果下降甚至失效的風(fēng)險(xiǎn)，使得雞球蟲病成為制約養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。

自90年代起，雞球蟲產(chǎn)生的抗藥性問題引起了國(guó)內(nèi)學(xué)者的廣泛關(guān)注，已有大量學(xué)者針對(duì)不同種類球蟲對(duì)不同藥物的耐藥性進(jìn)行了研究，但目前的耐藥性研究都需要建立感染球蟲的動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高，在養(yǎng)殖場(chǎng)遭遇感染時(shí)，無法快速高效的篩選到不耐藥的藥物，影響預(yù)防和治療效果。目前，還未見有通過體外實(shí)驗(yàn)對(duì)雞球蟲耐藥性進(jìn)行鑒定的方法，亟待開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：目前對(duì)柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的鑒定只有體內(nèi)方法，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，效率低下等問題。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案為：提供了一種柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法。該方法包括以下步驟：

a、柔嫩艾美耳球蟲的鑒定及分離

在養(yǎng)殖場(chǎng)取混合蟲株，進(jìn)行蟲種鑒定，確認(rèn)混合蟲株中存在柔嫩艾美耳球蟲；通過單卵囊分離技術(shù)，分離得到柔嫩艾美耳球蟲；

b、制備柔嫩艾美耳球蟲子孢子

將步驟a得到的柔嫩艾美耳球蟲離心，棄上清，加入PBS重懸后反復(fù)離心至上清液澄清，采用次氯酸鈉重懸沉淀，孵育8-12min，再次離心；再采用PBS重懸去除次氯酸鈉；將沉淀中加入PBS，進(jìn)行渦旋，每次渦旋10-20s，重復(fù)渦旋3-5次，待孢子囊-卵囊比率大于90％時(shí)，停止渦旋；將渦旋后的上清液采用PBS洗滌2-3次，將孢子囊離心，棄上清，將沉淀的孢子囊與胰蛋白酶和雞膽汁在PBS中混合，在40-41℃下孵育60-120min，每30min監(jiān)測(cè)一次脫囊率，孵育完成后，將游離的子孢子轉(zhuǎn)移到40-41℃的葡萄糖中，用安裝在無菌連接環(huán)上的5-μm過濾器通過真空過濾純化子孢子；然后再離心，洗滌，得到游離子孢子，培養(yǎng)于含有5-10％新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中；

c、MDBK細(xì)胞復(fù)蘇、傳代

取出MDBK凍存管，水浴解凍，離心，棄上清，沉淀轉(zhuǎn)入DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代；

采用PBS緩沖液清洗細(xì)胞瓶2-3次，采用胰蛋白酶消化細(xì)胞2-5分鐘，當(dāng)80％以上細(xì)胞被消化時(shí)，反復(fù)吹打細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，將細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；

d、MDBK細(xì)胞毒性檢測(cè)

使用MTT試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)，確定藥物的CC50值；

e、篩選確定藥物的最小抗球蟲濃度；