[發明專利]柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法

在審

• 申請號: 202310709620.1
• 申請日: 2023-06-15
• 公開（公告）號: CN116536390A
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 張潤慧;楊雪儷
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12N1/10;C12R1/90
• 代理公司: 北京和聯順知識產權代理有限公司 11621
• 代理人: 夏偉恒

1.柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、柔嫩艾美耳球蟲的鑒定及分離

在養殖場取混合蟲株，進行蟲種鑒定，確認混合蟲株中存在柔嫩艾美耳球蟲；通過單卵囊分離技術，分離得到柔嫩艾美耳球蟲；

b、制備柔嫩艾美耳球蟲子孢子

將步驟a得到的柔嫩艾美耳球蟲離心，棄上清，加入PBS重懸后反復離心至上清液澄清，采用次氯酸鈉重懸沉淀，孵育8-12min，再次離心；再采用PBS重懸去除次氯酸鈉；將沉淀中加入PBS，進行渦旋，每次渦旋10-20s，重復渦旋3-5次，待孢子囊-卵囊比率大于90％時，停止渦旋；將渦旋后的上清液采用PBS洗滌2-3次，將孢子囊離心，棄上清，將沉淀的孢子囊與胰蛋白酶和雞膽汁在PBS中混合，在40-41℃下孵育60-120min，每30min監測一次脫囊率，孵育完成后，將游離的子孢子轉移到40-41℃的葡萄糖中，用安裝在無菌連接環上的5-μm過濾器通過真空過濾純化子孢子；然后再離心，洗滌，得到游離子孢子，培養于含有5-10％新生牛血清的DMEM細胞培養基中；

c、MDBK細胞復蘇、傳代

取出MDBK凍存管，水浴解凍，離心，棄上清，沉淀轉入DMEM培養基中培養，待細胞生長至80-90％時，進行細胞傳代；

采用PBS緩沖液清洗細胞瓶2-3次，采用胰蛋白酶消化細胞2-5分鐘，當80％以上細胞被消化時，反復吹打細胞，將細胞轉移至離心管中離心，棄上清，將細胞在DMEM培養基培養；

d、MDBK細胞毒性檢測

使用MTT試劑盒進行細胞毒性檢測，確定藥物的CC50值；

e、篩選確定藥物的最小抗球蟲濃度；

將步驟a得到的游離子孢子與抗球蟲藥物同時接種于步驟c得到的MDBK細胞中進行培養，用PBS緩沖液洗滌，將樣品分為兩部分，一部分加入胰酶消化后收集并轉移至離心管中；另一部分加入含有5-10％新生牛血清的DMEM培養基，孵育至90-96h，孵育完成后使用胰酶消化收集并轉移至離心管中；采用qPCR實驗篩選各抗球蟲藥物的最小抗球蟲濃度；

f、采用最小抗球蟲濃度的藥物進行繁殖抑制率實驗，根據相對繁殖抑制率評價藥物的耐藥性。

2.根據權利要求1所述的柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法，其特征在于：滿足下述至少一項，

步驟b中PBS重懸后離心的條件為室溫下1200-1400xg離心8-12min；

或步驟b中加入氯酸鈉重懸后離心的條件為：室溫下2000-2500xg離心3-5min；

或步驟b所述孢子囊離心條件為2000-2500xg離心8-10min；

或步驟b所述的胰蛋白酶濃度為0.2-0.3％。

3.根據權利要求1所述的柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法，其特征在于：滿足下述至少一項，

步驟c所述水浴解凍的溫度為30-37℃；

或步驟c離心的條件為：1000-1500r/min離心3-5分鐘。

4.根據權利要求1所述的柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法，其特征在于：滿足下述至少一項，

步驟c所述DMEM培養基為含有10-15％新生牛血清的DMEM；

或步驟c所述培養的條件為36-37℃、5％CO₂條件下，培養12-24h；

或步驟c中消化后離心的條件為：1000-1500r/min離心3-5分鐘。

5.根據權利要求1所述的柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法，其特征在于：步驟d的藥物為地克珠利、磺胺氯吡嗪、鹽霉素、沙咪珠利、青蒿素或鹽酸氨丙啉。

6.根據權利要求5所述的柔嫩艾美耳球蟲耐藥性的體外鑒定方法，其特征在于：步驟d所述地克珠利、磺胺氯吡嗪、鹽霉素、沙咪珠利、青蒿素或鹽酸氨丙啉的CC50值分別為：30.47μM、24.52μM、28.64μM、87.66μM、30.67μM和32.74μM。