[發明專利]四氫嘧啶生物合成基因簇及發酵生產四氫嘧啶的方法

有效

• 申請號: 202310658895.7
• 申請日: 2023-06-06
• 公開（公告）號: CN116410950B
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 汪利文;張繼學;肖芳斌
• 申請（專利權）人: 云合（天津）生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N9/88;C12P17/12;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 邢月

本發明提供了一種四氫嘧啶生物合成基因簇及發酵生產四氫嘧啶的方法，該四氫嘧啶生物合成基因簇至少包括如下3個基因，分別為：ectA基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；ectB基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；ectC基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。本發明所述的四氫嘧啶生物合成基因簇微調了ectA、ectB、ectC的表達，并對ectA、ectB、ectC進行了定點突變，提高了菌種合成四氫嘧啶的能力。

技術領域

本發明屬于發酵工程領域，尤其是涉及一種四氫嘧啶生物合成基因簇及發酵生產四氫嘧啶的方法。

背景技術

四氫嘧啶，又名1，4，5，-四氫-2-甲基-4嘧啶羧酸，是一種環狀氨基酸衍生物，其作為一種相容性溶質，廣泛存在中度嗜鹽菌中。四氫嘧啶不僅可幫助微生物抵御高滲透壓沖擊，維持其生長，還可以對高溫、冷凍、射線等極端環境中細菌細胞的蛋白質、酶、核酸等起到保護作用。目前羥基四氫嘧啶已經廣泛應用于在化妝品、醫藥、基因工程等領域。

目前，四氫嘧啶的生產方法主要通過嗜鹽微生物特別是鹽單胞菌在高鹽環境下。這個過程通過采用被稱為“細菌擠奶法”的方式進行生產，即先在高滲透壓下培養細胞并在胞內積累四氫嘧啶，然后通過低滲沖擊刺激四氫嘧啶從胞內釋放到胞外，然后再重復進行高滲培養、低滲沖擊，以獲得較高濃度的四氫嘧啶。這個過程操作繁雜，且需要在高鹽條件下進行培養，因此對設備要求高，導致其生產價格十分昂貴。

公開號為CN104593442A的中國發明專利（公開日為2015年5月6日）公開了一種利用重組大腸桿菌轉化天冬氨酸為四氫嘧啶的方法，但該過程不連續，生產效率低。公開號為CN112342254B的中國發明專利（公開日為2021年4月23日）公開了一種利用重組大腸桿菌發酵生產四氫嘧啶的方法，但產量較低。因此開發一種高含量四氫嘧啶生產方法，降低其生產成本，提高生產效率，對四氫嘧啶的應用有重要的實踐意義。

發明內容

有鑒于此，本發明旨在克服現有技術中的缺陷，提出一種四氫嘧啶生物合成基因簇及發酵生產四氫嘧啶的方法。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

本發明提供一種四氫嘧啶生物合成基因簇，該四氫嘧啶生物合成基因簇至少包括如下3個基因，分別為：

ectA基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；

ectB基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；

ectC基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

所述的基因簇來源于伸長鹽單胞菌 Halomonas?elongata，ATCC?No：33173。

本發明還提供一種四氫嘧啶生物合成基因簇形成的突變體，該突變體包括如SEQID?NO.4、SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示的氨基酸序列。