[發(fā)明專利]評(píng)估與蛋白偶聯(lián)的核酸穩(wěn)定性的方法及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310655716.4
• 申請(qǐng)日: 2023-06-05
• 公開（公告）號(hào): CN116381125A
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳昊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 迦進(jìn)生物醫(yī)藥（上海）有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/96
• 分類號(hào): G01N30/96;G01N33/68
• 代理公司: 廣東普潤(rùn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44804
• 代理人: 寇闖

本發(fā)明適用于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種對(duì)與蛋白偶聯(lián)的核酸穩(wěn)定性進(jìn)行分析的方法，所述方法包括：a)將目標(biāo)核酸偶聯(lián)物與血漿混勻，孵育后儲(chǔ)存；b)使用結(jié)合目標(biāo)核酸偶聯(lián)物中的蛋白的免疫球蛋白對(duì)純化載體進(jìn)行包被；c)將包被后的純化載體與待測(cè)樣品進(jìn)行共孵育，獲得結(jié)合有待測(cè)樣品的純化載體；d)對(duì)目標(biāo)待測(cè)樣品進(jìn)行分離，并通過(guò)每個(gè)峰的保留時(shí)間以及260?nm和280?nm的相對(duì)吸收比值，對(duì)目標(biāo)待測(cè)樣品穩(wěn)定性進(jìn)行分析。本發(fā)明還提供了一種用于對(duì)與蛋白偶聯(lián)的核酸穩(wěn)定性進(jìn)行分析的試劑盒。本發(fā)明相對(duì)于傳統(tǒng)的核酸定量的PCR法，不需要引入外源探針來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可直接檢測(cè)蛋白?核酸偶聯(lián)物信號(hào)，步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)更有參考價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于評(píng)估與蛋白偶聯(lián)的核酸穩(wěn)定性的方法及試劑盒。

背景技術(shù)

核酸偶聯(lián)藥物技術(shù)是近年基于抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-Drug?Conjugates，ADC）、多肽偶聯(lián)藥物（Peptide-Drug?Conjugates，PDC）的上市和寡核苷酸療法（OligonucleotideTherapeutics）的成功發(fā)展起來(lái)的，具體是通過(guò)蛋白-核酸共價(jià)偶聯(lián)的方式，將抗體/多肽的組織靶向性與寡核苷酸療法對(duì)基因的精準(zhǔn)調(diào)控相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)特定組織、器官或細(xì)胞中致病相關(guān)基因表達(dá)水平的上調(diào)、下調(diào)或者剪切調(diào)控、序列編輯等效果。與非偶聯(lián)的核酸藥物相比，核酸偶聯(lián)藥物能夠有效改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征，降低脫靶毒性，降低藥物給藥劑量等優(yōu)勢(shì)，具有很強(qiáng)的創(chuàng)新性和廣闊的臨床應(yīng)用前景。

評(píng)價(jià)核酸藥物的穩(wěn)定性，是在核酸藥物、核酸偶聯(lián)藥物的早期開發(fā)中都非常關(guān)注的核心問(wèn)題之一。在核酸偶聯(lián)藥物中，決定靶向性的部分如抗體在循環(huán)系統(tǒng)中的降解相對(duì)緩慢，而決定藥效的核酸部分則較容易發(fā)生降解。這和兩類分子的生物學(xué)特性有關(guān)——蛋白作為生命活動(dòng)執(zhí)行者遍布全身，蛋白酶多分布在胞內(nèi)的特殊細(xì)胞器比如溶酶體中發(fā)揮作用；核酸作為遺傳信息的傳遞和儲(chǔ)存者，正常的活動(dòng)范圍局限于細(xì)胞內(nèi)，而核酸內(nèi)切酶和外切酶大量存在于生物體內(nèi)，作為對(duì)外源病原體的防御機(jī)制。

傳統(tǒng)的抗體或多肽偶聯(lián)藥物的穩(wěn)定性評(píng)估主要是通過(guò)質(zhì)譜的方法，先利用免疫共沉淀的原理，在完成血漿共孵育后，通過(guò)識(shí)別相應(yīng)抗原表位的免疫球蛋白（如單克隆抗體），將目標(biāo)ADC/PDC從樣品中捕獲，然后進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到偶聯(lián)藥物的完整性和藥物抗體比（drug-to-antibody?ratio，DAR）等信息。

但用以上方法對(duì)核酸偶聯(lián)藥物進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估，卻不太可行，因?yàn)樵谕瓿膳悸?lián)物的捕獲后，后續(xù)較難對(duì)完整的核酸蛋白偶聯(lián)物分子進(jìn)行質(zhì)譜分析。其原因在于：首先，現(xiàn)有生物大分子質(zhì)譜分析采取正離子模式，這會(huì)對(duì)核酸類帶有高度負(fù)電荷的分子及其偶聯(lián)物的離子化效率產(chǎn)生影響，使得難以基于質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行DAR值分析；其次，經(jīng)過(guò)血漿孵育的樣品，本身存在諸多降解產(chǎn)物，質(zhì)譜能夠較好地定義小分子的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜信號(hào)，但較難對(duì)分子量較大（幾kDa~十幾kDa）且具有四堿基（A/U/C/G）重復(fù)結(jié)構(gòu)的核酸分子進(jìn)行譜圖解析，因?yàn)楹怂徭溤陔婋x時(shí)的斷裂方式排列組合的可能性非常之多，且可重復(fù)性較差，較難判斷不同樣品間相應(yīng)的差異是穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生的還是質(zhì)譜分析過(guò)程中引入的，故難以對(duì)核酸偶聯(lián)物的穩(wěn)定性進(jìn)行準(zhǔn)確表征。

傳統(tǒng)的未偶聯(lián)蛋白或多肽的寡核苷酸分子，其血漿穩(wěn)定性測(cè)試的經(jīng)典方法是先進(jìn)行樣品中的核酸組分提取，再采用Northen?blot的方式，或者Stemloop-qPCR的方式進(jìn)行定量，前者操作步驟復(fù)雜且涉及同位素操作，后者需要引入外源的探針，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)的靈敏度也存在較大問(wèn)題。若用此類方法來(lái)對(duì)核酸蛋白偶聯(lián)物進(jìn)行血漿穩(wěn)定性測(cè)試，還需要克服核酸的提取問(wèn)題：使用常規(guī)的核酸提取手段比如酚氯仿抽提，蛋白質(zhì)部分會(huì)沉淀，這會(huì)影響到目標(biāo)核酸分子的回收；若采取蛋白酶切的方式進(jìn)行處理，又會(huì)增加可變因素和樣品制備的繁瑣程度；即使采取了適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚淼玫搅酥貜?fù)性較好的結(jié)果，由于蛋白已經(jīng)被去除，原始樣品中偶聯(lián)物DAR值和各組分占比的信息也因此丟失。