[發(fā)明專利]長林小蠹SS-COI PCR檢測引物以及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310650254.7
• 申請日: 2023-06-02
• 公開（公告）號: CN116656835A
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發(fā)明（設計）人: 姚艷霞;李承錦;黃誼青;林若竹;淮穩(wěn)霞;王小藝;趙文霞
• 申請（專利權）人: 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護研究所（國家林業(yè)和草原局世界自然遺產保護研究中心）
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11;C12Q1/686
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發(fā)明公開了長林小蠹SS?COI?PCR檢測引物以及檢測方法。本發(fā)明根據長林小蠹完整COI序列中與近緣種差異較大的部分獲得了特異性引物對，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。在此基礎上，本發(fā)明提供了長林小蠹SS?COI?PCR檢測方法以及長林小蠹SS?COI?PCR檢測試劑盒，特異性檢測結果表明，本發(fā)明建立的檢測方法具有良好的特異性，能夠特異性擴增長林小蠹，對于長林小蠹的近緣種均不能擴增，適用于長林小蠹的快速精準檢測；靈敏度檢測結果表明，本發(fā)明提供的長林小蠹SS?COI?PCR檢測方法檢測靈敏度高，檢測限位DNA濃度為8.7×10supgt;?2/supgt;ng/μL。

技術領域

本發(fā)明涉及昆蟲PCR檢測引物以及檢測方法，尤其涉及長林小蠹SS-COI?PCR檢測引物以及檢測方法，屬于長林小蠹分子檢測領域。

背景技術

長林小蠹(Hylurgus?ligniperda?Fabricius)(鞘翅目Coleoptera：象甲科Curculionidae)是中國新入侵的重要害蟲，在山東省泰安市、煙臺市、青島市和威海市成功定殖且造成嚴重危害。長林小蠹在外部形態(tài)特征方面與華山松大小蠹、云杉大小蠹、縱坑切稍小蠹等種類十分相似，需要專業(yè)的昆蟲分類學家進行種類識別與鑒定，難以滿足口岸、海關及林業(yè)一線人員開展檢疫工作的實際需求，十分不利于外來入侵種檢疫管理及應急處置，亟需研發(fā)長林小蠹快速精準檢測識別技術，以實現外來入侵種早期識別的重要目標，這對防止外來種侵害和生物安全起著十分重要的作用。

在采用PCR技術進行長林小蠹檢測時，需要篩選得到高特異性和高靈敏度的PCR引物，才能實現長林小蠹快速、精準檢測和識別。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的之一是提供長林小蠹SS-COI?PCR檢測引物；

本發(fā)明的目的之二是提供一種長林小蠹SS-COI?PCR檢測方法；

本發(fā)明的目的之三是提供一種長林小蠹SS-COI?PCR檢測試劑盒。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

本發(fā)明首先提供了長林小蠹SS-COI?PCR檢測引物，其中，所述長林小蠹SS-COIPCR檢測引物由核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示的上游引物和核苷酸序列為SEQ?ID?No.2所示的下游引物組成。

本發(fā)明的另一方面是提供了長林小蠹SS-COI?PCR檢測試劑盒，包括：2×FlashPCR?MasterMix，長林小蠹SS-COI?PCR檢測引物，ddH₂O；其中，所述長林小蠹SS-COI?PCR檢測引物由核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示上游引物和核苷酸序列為SEQ?ID?No.2所示下游引物組成

本發(fā)明的另一方面是提供了一種長林小蠹SS-COI?PCR檢測方法，包括：

(1)提取待檢測樣品DNA；

(2)以待檢測樣品DNA為模板，以長林小蠹SS-COI?PCR檢測上游引物HLSSCOIF和下游引物HLSSCOIR建立PCR擴增體系并進行PCR擴增反應；

(3)若待檢測樣品出現474bp的擴增條帶，則待檢測樣品為長林小蠹。

作為本發(fā)明優(yōu)選的具體實施方式，步驟(2)中所建立的PCR擴增體系為：2×FlashPCR?MasterMix(Dye)12.5μL、上游引物HLSSCOIF?1μL、下游引物HLSSCOIR?1μL、基因組DNA模板1.5μL、ddH₂O?9μL。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的具體實施方式，步驟(2)中所述的PCR擴增的反應程序為：98℃預變性30s，94℃變性10s，54℃或55℃退火15s，72℃延伸15s，共34個循環(huán)，最后72℃延伸1min。