[發明專利]單鏈接頭預連接方法、高通量測序文庫的建庫方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202310589723.9
• 申請日: 2023-05-24
• 公開（公告）號: CN116287124A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 徐煒;孫長斌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業基因組研究所
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 路秀麗

本發明提供了一種單鏈接頭預連接方法、高通量測序文庫的建庫方法及試劑盒。其中，該單鏈接頭預連接方法包括：a）利用末端轉移酶將樣本DNA的3'端進行延伸形成外延的單鏈DNA結構，獲得延伸DNA；b）在夾板的作用下，將延伸DNA和單鏈接頭進行連接，獲得預連接缺刻DNA，單鏈DNA結構3'端和單鏈接頭的5'端相鄰并存在缺刻；c）利用DNA連接酶以磷酸二酯鍵連接缺刻，獲得單鏈接頭預連接DNA；其中，單鏈接頭從5'端至3'端依次包括：夾板互補區域、條形碼區域和測序接頭區域。能夠解決現有技術中對于特殊形態的DNA結構基于雙鏈DNA的建庫方法難以進行標記建庫的問題，實現多樣本同步建庫，適用于高通量測序領域。

技術領域

本發明涉及高通量測序領域，具體而言，涉及一種單鏈接頭預連接方法、高通量測序文庫的建庫方法及試劑盒。

背景技術

高通量二代測序技術的快速發展，測序成本的不斷降低，已經廣泛應用于人類疾病的篩查和診斷、分子育種等領域，產生了巨大的經濟和社會效益。測序文庫的構建，是高通量測序技術的關鍵技術環節之一，其中對不同樣本建立索引（indexing），即標記一段條形碼序列（barcode），可實現多個樣本同步測序，是建庫測序的重要策略，能夠提高建庫通量、縮短建庫周期、降低建庫成本。

當前，對樣本建立索引主要還是在文庫構建的最后一步擴增環節，前期大部分步驟仍需對單個樣本分別進行操作，造成建庫成本居高不下，且一定時間范圍內開展建庫的樣本數量也會受到很大的限制。因而，樣本DNA起始階段標記技術的開發，可實現多個樣本混合一起進行后續文庫的構建，提高建庫效率和通量。由此建立的高通量建庫方法，不僅能夠降低建庫成本，并且一定程度上可以消減每個樣本分別建庫過程中因試劑、儀器、操作等引起的批次效應。

近期，已開發了一些技術對樣本進行標記，如（1）通過Tn5轉座酶把帶有標簽的寡核苷酸接頭插入到基因組DNA中，構建了一系列微量、超微量甚至單細胞水平的文庫構建技術，這些技術包括scATAC-seq、CUTTag、CoBATCH、CoTECH等；（2）通過攜帶有標簽的引物對基因組進行擴增，如基于10×?Genomics的scRNA-seq（https://www.10xgenomics.com/）等；（3）對樣本進行接頭預連接，在建庫的起始階段使用攜帶有標簽的接頭進行連接標記樣本，標記后的樣本混合后即可同步進行建庫的后續操作，如iChIP、Co-ChIP等。這些方法大大促進了測序建庫技術的發展及其在生物學領域的應用，但仍然存在局限性：以雙鏈DNA為底物進行文庫的構建。在基因組中，除了雙鏈DNA還存在大量單鏈DNA、DNA-RNA雜合鏈等形態。對于這些形態的DNA，現有的上述基于雙鏈DNA的建庫方法無法進行標記和建庫。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種單鏈接頭預連接方法、高通量測序文庫的建庫方法及試劑盒，以解決現有技術中對于特殊形態的DNA結構基于雙鏈DNA的建庫方法難以進行標記建庫的問題。

為了實現上述目的，根據本發明的第一個方面，提供了一種單鏈接頭預連接方法，該單鏈接頭預連接方法包括：a）利用末端轉移酶將樣本DNA的3'端進行延伸形成外延的單鏈DNA結構，獲得延伸DNA；b）在夾板的作用下，將延伸DNA和單鏈接頭進行連接，獲得預連接缺刻DNA，單鏈DNA結構3'端和單鏈接頭的5'端相鄰并存在缺刻；c）利用DNA連接酶以磷酸二酯鍵連接缺刻，獲得單鏈接頭預連接DNA；其中，單鏈接頭從5'端至3'端依次包括：夾板互補區域、條形碼區域和測序接頭區域；條形碼區域為4-12個堿基組合的序列；夾板包括5'端的單鏈接頭結合區和3'端的目標片段結合區；單鏈接頭結合區與夾板互補區域互補配對；目標片段結合區與外延的單鏈DNA結構互補配對。