[發明專利]單鏈接頭預連接方法、高通量測序文庫的建庫方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202310589723.9
• 申請日: 2023-05-24
• 公開（公告）號: CN116287124A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 徐煒;孫長斌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業基因組研究所
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 路秀麗

1.一種單鏈接頭預連接方法，其特征在于，所述單鏈接頭預連接方法包括：

a）利用末端轉移酶將樣本DNA的3'端進行延伸形成外延的單鏈DNA結構，獲得延伸DNA；

b）在夾板的作用下，將所述延伸DNA和單鏈接頭進行連接，獲得預連接缺刻DNA，所述單鏈DNA結構3'端和所述單鏈接頭的5'端相鄰并存在缺刻；

c）利用DNA連接酶以磷酸二酯鍵連接所述缺刻，獲得單鏈接頭預連接DNA；

其中，所述單鏈接頭從5'端至3'端依次包括：夾板互補區域、條形碼區域和測序接頭區域；

所述條形碼區域為4-12個堿基組合的序列；

所述夾板包括5'端的單鏈接頭結合區和3'端的目標片段結合區；

所述單鏈接頭結合區與所述夾板互補區域互補配對；

所述目標片段結合區與所述外延的單鏈DNA結構互補配對。

2.根據權利要求1所述的單鏈接頭預連接方法，其特征在于，在所述單鏈接頭的所述夾板互補區域和所述條形碼區域之間還包括唯一標識符區域。

3.根據權利要求1所述的單鏈接頭預連接方法，其特征在于，所述測序接頭區域的3'端含有3'封閉修飾。

4.根據權利要求1所述的單鏈接頭預連接方法，其特征在于，所述目標片段結合區包括（AAAA）_n、（CCCC）_n、（GGGG）_n、（TTTT）_n、（RRRR）_n、（YYYY）_n、（KKKK）_n、（MMMM）_n、（SSSS）_n、（WWWW）_n、（BBBB）_n、（DDDD）_n、（HHHH）_n、（VVVV）_n或（NNNN）_n，其中n表示堿基個數，n為4-8中任意整數；大寫字母表示不同脫氧核苷酸堿基類型或組合，其中A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；G：鳥嘌呤；Y：胞嘧啶或胸腺嘧啶；R：腺嘌呤或鳥嘌呤；M：腺嘌呤或胞嘧啶；K：鳥嘌呤或胸腺嘧啶；W：腺嘌呤或胸腺嘧啶；S：胞嘧啶或鳥嘌呤；V：腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤；H：腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶；D：腺嘌呤、鳥嘌呤或胸腺嘧啶；B：胞嘧啶、鳥嘌呤或胸腺嘧啶；N：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。

5.根據權利要求1所述的單鏈接頭預連接方法，其特征在于，所述a）、所述b）和所述c）能夠分步或同時進行，獲得所述單鏈接頭預連接DNA。

6.根據權利要求1所述的單鏈接頭預連接方法，其特征在于，樣本DNA包括雙鏈DNA、單鏈DNA或DNA-RNA雜合鏈中的一種或多種。

7.根據權利要求1所述的單鏈接頭預連接方法，其特征在于，將所述樣本DNA、所述夾板、所述DNA連接酶和所述單鏈接頭混合于T4?RNA連接酶緩沖液或T4?DNA連接酶緩沖液中，形成連接體系。

8.根據權利要求7所述的單鏈接頭預連接方法，其特征在于，所述連接體系中含有聚乙二醇；所述聚乙二醇包括PEG2000、PEG4000、PEG6000或PEG8000中的一種或多種；所述聚乙二醇在所述連接體系中的質量濃度為5%-30%。

9.根據權利要求1所述的單鏈接頭預連接方法，其特征在于，脫氧核糖核苷酸三磷酸包括脫氧腺苷5'-三磷酸、脫氧鳥苷5'-三磷酸、脫氧胞苷5'-三磷酸和脫氧胸腺苷5'-三磷酸其中的一種、兩種、三種或四種，在所述單鏈接頭預連接方法中，所述末端轉移酶催化各所述脫氧核糖核苷酸三磷酸結合至所述樣本DNA的3'端羥基，各所述脫氧核糖核苷酸三磷酸依次結合形成所述單鏈DNA結構。