[發明專利]一種分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202310582768.3
• 申請日: 2023-05-23
• 公開（公告）號: CN116622533A
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 李承;姜睿康;薛怡蕓;李振;張天元
• 申請（專利權）人: 蘇州聚維元創生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/31;C12N15/56;C12R1/84
• 代理公司: 天津市君硯知識產權代理有限公司 12239
• 代理人: 高文迪

本發明公開了一種分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母及其構建方法和應用，熱休克轉錄因子來源于釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)，所述熱休克轉錄因子突變體為突變體Hsf1supgt;R206S/supgt;，所述突變體Hsf1supgt;R206S/supgt;為熱休克轉錄因子1Hsf1的第206位的精氨酸突變為絲氨酸的突變體。本發明的重組畢赤酵母可以提高外源蛋白表達量，有利于畢赤酵母作為酶制劑生產菌株的廣發應用，具體的，本發明的重組畢赤酵母在生產木聚糖酶時，相對于原菌種，木聚糖酶的酶活力增加32％，蛋白濃度增加41％。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別是涉及一種分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母及其構建方法和應用。

背景技術

巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)是一種甲醇營養型酵母，畢赤酵母表達體系是目前應用最廣泛的外源蛋白表達系統之一。大量的研究表明畢赤酵母具有以下幾個特點：①分子遺傳操作相對簡單，重組菌株較穩定；②具有強誘導的啟動子AOX1，在甲醇誘導下外源蛋白表達量高；③容易實現高密度培養(130g·L-1)；④營養要求低，生長快，培養基價格低廉；⑤適度的蛋白折疊、翻譯后修飾和糖基化，適用于藥用蛋白的生產及穩定性的提高。目前已有數百種外源蛋白實現了在畢赤酵母中的高效表達，蛋白的表達量高達幾到十幾g·L^-1水平，許多畢赤酵母表達的外源蛋白已實現了工業化生產，如木聚糖酶、脂肪酶和人生長激素等。除了廣泛地應用于生產工業及藥用蛋白，畢赤酵母還被作為模式生物用于分析過氧化物酶體的合成以及研究外源蛋白的表達和分泌機理。要實現外源蛋白在畢赤酵母中的高效分泌表達必須根據基因本身的特性進行合理的設計才能獲得，大量研究證明，內質網中蛋白的折疊壓力是外源蛋白分泌的主要限速步驟。緩解內質網壓力對于提高外源蛋白分泌表達具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中存在的內質網中蛋白的折疊壓力時外源蛋白分泌的限速，而提供一種分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母。

本發明的另一目的，提供一種所述重組畢赤酵母的構建方法。

本發明的另一目的，提供一種所述重組畢赤酵母的應用。

為實現本發明的目的所采用的技術方案是：

一種分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母(Pichia?pastoris)，熱休克轉錄因子來源于釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)，所述熱休克轉錄因子突變體為突變體Hsf1^R206S，所述突變體Hsf1^R206S為熱休克轉錄因子1Hsf1的第206位的精氨酸突變為絲氨酸的突變體。

在上述技術方案中，所述重組畢赤酵母保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)，保藏號：CGMCC?No.36937，保藏日期：2023年3月28日。

在上述技術方案中，所述突變體Hsf1^R206S的氨基酸序列如Seq?No.2所示。

在上述技術方案中，表達所述突變體Hsf1^R206S的DNA序列如Seq?No.1所示。

在上述技術方案中，所述突變體Hsf1^R206S的DNA通過構建表達載體pPICZA-Hsf1^R206S線性化轉化入畢赤酵母，優選的，所述突變體Hsf1^R206S的DNA及其調節基因構成的表達盒整合到畢赤酵母的基因組中。

在上述技術方案中，所述重組畢赤酵母通過以下方法構建：

將表達載體pPICZA-Hsf1^R206S經單酶切線性化并純化后電轉化畢赤酵母感受態細胞，然后進行陽性轉化子篩選。