[發明專利]一種分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202310582768.3
• 申請日: 2023-05-23
• 公開（公告）號: CN116622533A
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 李承;姜睿康;薛怡蕓;李振;張天元
• 申請（專利權）人: 蘇州聚維元創生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/31;C12N15/56;C12R1/84
• 代理公司: 天津市君硯知識產權代理有限公司 12239
• 代理人: 高文迪

1.一種分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母(Pichia?pastoris)，其特征在于，熱休克轉錄因子來源于釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)，所述熱休克轉錄因子突變體為突變體Hsf1^R206S，所述突變體Hsf1^R206S為熱休克轉錄因子1Hsf1的第206位的精氨酸突變為絲氨酸的突變體。

2.如權利要求1所述的分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母，其特征在于，所述重組畢赤酵母保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號：CGMCC?No.26937，保藏日期：2023年3月28日。

3.如權利要求1所述的分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母，其特征在于，所述突變體Hsf1^R206S的氨基酸序列如Seq?No.2所示。

4.如權利要求3所述的分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母，其特征在于，表達所述突變體Hsf1^R206S的DNA序列如Seq?No.1所示。

5.如權利要求4所述的分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母，其特征在于，所述突變體Hsf1^R206S的DNA通過構建表達載體pPICZA-Hsf1^R206S線性化轉化入畢赤酵母，優選的，所述突變體Hsf1^R206S的DNA及其調節基因構成的表達盒整合到畢赤酵母的基因組中。

6.如權利要求5所述的分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母，其特征在于，所述重組畢赤酵母通過以下方法構建：

將表達載體pPICZA-Hsf1^R206S經單酶切線性化并純化后電轉化畢赤酵母感受態細胞，然后進行陽性轉化子篩選。

7.如權利要求5所述的分泌熱休克轉錄因子突變體的重組畢赤酵母，其特征在于，所述表達載體pPICZA-Hsf1^R206S通過以下方法構建：

步驟1，將HSF1的618位點的堿基G突變堿基C，設計引物Hsf1-S和Hsf-R206S-A與Hsf-R206S-S和Hsf1-A；

步驟2，以釀酒酵母基因組作為模板，引物Hsf1-S和Hsf-R206S-A與Hsf-R206S-S和Hsf1-A擴增HSF1基因的上下部分，以膠回收純化后的PCR產物為模板，以引物Hsf1-S和Hsf1-A通過PCR擴增HSF1^R206S基因；

步驟3，培養大腸桿菌菌株pPICZA、收集細胞，分離、提取質粒pPICZA，用連接酶將步驟2得到的模板進行雙酶切與同樣經過相同內切酶雙酶切的質粒pPICZA連接，連接產物化學轉化大腸桿菌E.coli?Top10，平板篩選陽性轉化子，陽性轉化子提取鑒定正確的質粒，得到重組質粒pPICZA-Hsf1^R206S。