[發(fā)明專利]一種同時(shí)檢測(cè)CyHV-2和CyHV-3的雙重TaqMan熒光定量PCR引物和探針組及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310576195.3
• 申請(qǐng)日: 2023-05-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116479187A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳永聰;方勤美
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州君誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)檢測(cè)CyHV?2和CyHV?3的雙重TaqMan熒光定量PCR引物和探針組及應(yīng)用。所述引物和探針組為CyHV?2?F、CyHV?2?R、CyHV?2?P、CyHV?3?F、CyHV?3?R和CyHV?3?P，序列分別如SEQ?ID?NO:1~SEQ?ID?NO:6所示。采用本發(fā)明的引物和探針組可以同時(shí)檢測(cè)CyHV?2和CyHV?3，建立的CyHV?2和CyHV?3雙重Taqman?qPCR檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏性高和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床上CyHV?2和CyHV?3的快速定量檢測(cè)和鑒別診斷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)CyHV-2和CyHV-3的雙重TaqMan熒光定量PCR引物和探針組及應(yīng)用。

背景技術(shù)

鯽魚(yú)和鯉魚(yú)是我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類，同時(shí)也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，因其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美而深受消費(fèi)者青睞，為人們提供了重要的蛋白質(zhì)來(lái)源。金魚(yú)和錦鯉歷來(lái)都是重要的觀賞魚(yú)類，因其承載了人們的情感寄托，在市場(chǎng)均具有較高的個(gè)體經(jīng)濟(jì)價(jià)值。通過(guò)雜交選育技術(shù)，我們培育出了許多優(yōu)質(zhì)的雜交品種，如異育銀鯽、湘云鯽等雜交鯽魚(yú)以及豐鯉、荷元鯉等雜交鯉，極大地豐富了水產(chǎn)養(yǎng)殖品系。

鯉皰疹病毒是一種極易感染錦鯉、金魚(yú)、鯽魚(yú)、鯉魚(yú)等鯉科魚(yú)類及其雜交種的病毒，其病程發(fā)展迅速、傳染性強(qiáng)、發(fā)病范圍廣，目前尚無(wú)有效的治療方式，一旦爆發(fā)該疾病將會(huì)給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。感染鯉科魚(yú)類的皰疹病毒有鯉痘瘡病毒(Cyprinid?herpesvirus-1,CyHV-1)、鯉皰疹病毒2型(CyHV-2)和鯉皰疹病毒3型(CyHV-3)三種類型，屬于異皰疹病毒科鯉皰疹病毒屬，其中以CyHV-2和CyHV-3具有高致死率而備受關(guān)注。該疾病可引起各生長(zhǎng)階段鯉科魚(yú)類如鯉魚(yú)和錦鯉腎臟紅腫出血、爛鰓和呼吸困難從而導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重危害鯉魚(yú)和錦鯉的養(yǎng)殖。

目前已知的檢測(cè)鯉皰疹病毒的方法包括臨床診斷、透射電鏡觀察、酶聯(lián)免疫、免疫熒光及PCR檢測(cè)等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，qPCR因其快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于病原檢測(cè)。CyHV-2和CyHV-3可感染大部分的鯉科魚(yú)類，致死率高但對(duì)不同鯉科魚(yú)類致病力也不一樣，其中CyHV-2主要危害鯽魚(yú)、金魚(yú)及其雜交種，可引起造血組織壞死從而導(dǎo)致死亡，鯉、錦鯉及其雜交種對(duì)鯉皰疹病毒3型更敏感。由于不同鯉皰疹病毒對(duì)不同品種鯉科魚(yú)類產(chǎn)生的危害不同，開(kāi)發(fā)一種可同時(shí)檢測(cè)兩種類型鯉皰疹病毒的方法顯得非常重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)CyHV-2和CyHV-3的雙重TaqMan熒光定量PCR引物和探針組及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明針對(duì)CyHV-2型與3型病毒的保守區(qū)多個(gè)基因序列設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，篩選出2對(duì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)鯉皰疹病毒2型和3型的雙重TaqMan?qPCR方法，該引物擴(kuò)增CyHV-2型與3型特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率較高，該檢測(cè)方法基于對(duì)應(yīng)病毒的保守區(qū)引物建立，可快速準(zhǔn)確檢測(cè)到病毒，為鯉皰疹病毒的診斷提供了重要的實(shí)驗(yàn)室手段。

本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于同時(shí)檢測(cè)鯉皰疹病毒2型和3型的雙重TaqMan熒光定量PCR引物和探針組，其由CyHV-2的上游引物CyHV-2-F、下游引物CyHV-2-R和探針CyHV-2-P以及CyHV-3的上游引物CyHV-3-F、下游引物CyHV-3-R和探針CyHV-3-P組成，所述CyHV-2-F、CyHV-2-R、CyHV-2-P、CyHV-3-F、CyHV-3-R、CyHV-3-P的核苷酸序列及修飾依次如下所示：

CyHV-2-F：CACCACCATCACCACCTAGTA(SEQ?ID?NO:1)；

CyHV-2-R：TCATCATCATCATCATCGGACTCT(SEQ?ID?NO:2)；

CyHV-2-P：FAM-ACCTGTGGTAGCGCCAGACCT-BHQ1(SEQ?ID?NO:3)；