[發明專利]一種轉化合成酪醇的苯丙酮酸脫羧酶突變體及其應用

在審

• 申請號: 202310575370.7
• 申請日: 2023-05-22
• 公開（公告）號: CN116622688A
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 夏媛媛;齊麗娜;是徐蕾;陳獻忠;楊海泉;沈微
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種轉化合成酪醇的苯丙酮酸脫羧酶突變體及其應用，屬于生物技術領域。本發明提供了苯丙酮酸脫羧酶突變體ARO10supgt;D331S/supgt;、ARO10supgt;D331V/supgt;和ARO10supgt;D331C/supgt;，并采用E.coli?YMGR作為宿主菌株，以pKK223?3質粒為載體表達了釀酒酵母中苯丙酮酸脫羧酶突變體ARO10supgt;D331S/supgt;、ARO10supgt;D331V/supgt;和ARO10supgt;D331C/supgt;。該菌株在裝有50mL?M9Y培養基的250mL搖瓶中發酵，酪醇產量分別為1.91g/L、2.02g/L、2.04g/L，高于目前絕大多數研究團隊的成果。

技術領域

本發明涉及一種轉化合成酪醇的苯丙酮酸脫羧酶突變體及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

酪醇(tyrosol)是一種天然的單酚類化合物，在食品、化妝品、營養補充劑和醫藥行業中應用廣泛。它是已知的最強天然抗氧化劑之一，例如抗氧化和抗癌，并且具有充當心臟和神經保護劑的潛力。因此，酪醇具有巨大的商業應用價值，而大規模生產酪醇成為一種必然的趨勢。目前我國對酪醇的生產仍然處于天然提取和化學合成階段。天然提取主要是從紅景天苷、橄欖果、葉以及在橄欖油制備過程中產生的殘渣和廢水中進行，其優點是原始材料便宜且豐富，但缺點是使用強酸性水蒸汽，回收率低，且易產生二次污染。而化學合成使用的基質相對昂貴，并且這些過程通常需要保護和脫保護步驟，降低總收率；成本高、污染嚴重、安全性低，不能應用于食品及藥品的添加。

目前已知的酪醇作用就有多種：(1)心血管藥物美托洛爾、倍他洛克等的合成：對動脈硬化、高血壓、心臟病、腦溢血等預防與治療；(2)安全高效的抗氧劑：應用于美容產品保健品；(3)高效穩定的抗炎性：抑制過敏性炎癥等疾病；(4)抗衰老、對骨骼系統有益處：有助于人體對礦物質的吸收，減少骨骼疏松；(5)提高內分泌系統功能，促進新陳代謝，促進傷口愈合，消除體內自由基，恢復人體臟腑器官的健康狀態，延緩衰老；(6)抗癌防癌：促進癌癥后期恢復和提高化療效果。因此，大規模生產酪醇成為必然的一種趨勢。

在現有報道當中，雖然已有安全高效的生物法合成酪醇，例如：通過在大腸桿菌中表達來自釀酒酵母的苯丙酮酸脫羧酶ARO10生產酪醇(文章《High-level?production?oftyrosol?with?noninduced?recombinant?escherichia?coli?by?metabolicengineering》)，產量有待進一步提高。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高活性苯丙酮酸脫羧酶突變體以及安全高效、價格低廉的生物法合成酪醇的方法。

本發明提供了苯丙酮酸脫羧酶ARO10突變體，所述苯丙酮酸脫羧酶突變體是在氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示的親本酶ARO10的基礎上，進行了如下任一種突變：

(1)將第331位的天冬氨酸突變為絲氨酸，命名為ARO10^D331S；氨基酸序列如SEQ?IDNO.1所示；

(2)將第331位的天冬氨酸突變為纈氨酸，命名為ARO10^D331V；氨基酸序列如SEQ?IDNO.2所示；

(3)將第331位的天冬氨酸突變為半胱氨酸，命名為ARO10^D331C；氨基酸序列如SEQID?NO.3所示；

在一種實施方式中，所述親本酶苯丙酮酸脫羧酶ARO10來源于釀酒酵母。

在一種實施方式中，編碼所述苯丙酮酸脫羧酶ARO10的基因的核苷酸序列如SEQID?NO.4所示。

本發明還提供了編碼所述苯丙酮酸脫羧酶突變體ARO10?^D331S、ARO10?^D331V或ARO10^D331C的基因。