[發明專利]一種畢赤酵母基因編輯單一質粒及改進的基因編輯方法

有效

• 申請號: 202310574853.5
• 申請日: 2023-05-22
• 公開（公告）號: CN116286941B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發明（設計）人: 黃火清;劉波;張紅蓮;徐欣欣;楊浩萌;王苑;涂濤;柏映國;張偉;羅會穎;姚斌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/65;C12N15/63;C12R1/84
• 代理公司: 北京法信智言知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11737
• 代理人: 高宇

本發明涉及基因編輯領域，具體涉及一種畢赤酵母基因編輯單一質粒及改進的基因編輯方法。根據本申請的技術方案，在構建基因編輯質粒時只需兩輪PCR和一次無縫重組即可完成基因編輯質粒的構建，第一輪PCR用于擴增左右同源序列、第二輪PCR用于將左右同源序列進行融合。在刪除基因時，只需轉入單一的基因編輯質粒即可。完成基因編輯后，將陽性轉化子接入含有鼠李糖的培養基中培養，通過鼠李糖誘導啟動子調控毒性蛋白MazF表達，即可快速消除細胞中質粒pPICC02及其衍生體；相對于現有的在無選擇壓力下多次傳代來消除質粒的策略，此法快速簡潔。基于本申請的基因編輯質粒的基因編輯方法可實現基因快速高效編輯，有很好的應用潛力。

技術領域

本發明涉及基因編輯領域，具體涉及一種畢赤酵母基因編輯單一質粒及改進的基因編輯方法。

背景技術

畢赤酵母是當前應用最廣泛的重組蛋白表達宿主之一，已有數千種重組蛋白得以成功表達。隨著合成生物學技術的發展，畢赤酵母亦逐漸被開發為合成小分子化合物的底盤細胞。在畢赤酵母中高效合成內源或異源化合物時，需要應用基因編輯技術重塑已有的代謝途徑或引入新的代謝途徑。然而，畢赤酵母細胞內的同源重組效率低下，通過同源重組途徑實現畢赤酵母基因精準編輯效率低下。CRISPR/Cas9系統中內切酶Cas9在gRNA指導下切割染色體的特定位點，在細胞內引入切割位點兩端的同源序列顯著提升了基因精準編輯效率。完成基因編輯之后，用于基因編輯的質粒通過無選擇壓力下傳代從細胞中消除。

CRISPR/Cas12a系統作為另一套CRISPR/Cas系統，相對于CRISPR/Cas9系統，具有自主形成成熟的crRNA且crRNA長度較短的優勢，構建基因敲除質粒更簡便。基于CRISPR/Cas12a系統的基因編輯體系中存在兩個質粒，先將第一個質粒整合于畢赤酵母染色體上，從而構建表達蛋白Cas12a的畢赤酵母菌株，再導入表達gRNA的質粒和帶有待敲除基因兩側同源臂的PCR產物。整體來講，基因刪除過程較為繁瑣，周期亦較長；編碼內切酶Cas12a的基因 cas12a整合于染色體，在畢赤酵母染色體上留下痕跡，其在細胞內組成型表達有一定毒性的Cas12a，亦會潛在影響畢赤酵母生長或其它性能。此外，基因敲除質粒需要在無選擇壓力下緩慢消除，進一步延長了基因編輯效率。因而，建立簡化快速的畢赤酵母基因編輯系統有重要的現實需求。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于畢赤酵母基因編輯單一質粒。

本發明的另一目的是提供一種改進的畢赤酵母基因編輯方法。

根據本發明的畢赤酵母基因編輯單一質粒，從轉錄復制起點至下游依次包括：基因編輯元件、質粒快速消除元件，其中，所述基因編輯元件包括在畢赤酵母細胞中穩定遺傳的自主復制序列、啟動crRNA和gRNA轉錄的啟動子、內切酶Cas12a表達盒、轉化子正向篩選的抗性標記（Zeocin）；所述質粒快速消除元件MazF依次包括鼠李糖誘導啟動子、MazF片段、終止子。

根據本發明的用于畢赤酵母基因編輯的質粒，所述內切酶Cas12a表達盒包括三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、蛋白Cas12a的編碼基因、基因 adh終止子。

根據本發明的畢赤酵母基因編輯方法，所述方法包括以下步驟：

擴增目的被編輯基因的左右同源序列；

將所述被編輯基因的左右同源序列與上述畢赤酵母基因編輯單一質粒融合；

將融合獲得的質粒轉入畢赤酵母，篩選獲得陽性轉化子；

將陽性轉化子接入含有鼠李糖的培養基中培養，通過鼠李糖誘導啟動子調控毒性蛋白MazF表達，消除細胞中的畢赤酵母基因編輯單一質粒。