[發明專利]一種蛋白核小球藻葉綠素合成缺陷型突變株及其應用

在審

• 申請號: 202310572307.8
• 申請日: 2023-05-19
• 公開（公告）號: CN116574613A
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發明（設計）人: 魏東;陳霄
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;A23L33/10;C12R1/89
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜

本發明公開了一種蛋白核小球藻葉綠素合成缺陷型突變株及其應用。該突變株為蛋白核小球藻(Auxenochlorella?pyrenoidosa)CX41和蛋白核小球藻(Auxenochlorella?pyrenoidosa)MC8中的至少一株，均于2023年04月14日保藏于廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓的廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號分別為GDMCC?No:63357和GDMCC?No:63358。本發明中的突變株CX41和MC8的葉綠素a含量比野生型降低了98％以上，無葉綠素b，可用于生產蛋白和葉黃素，為發酵生產替代蛋白提供了高品質、高產能的優良藻種。

技術領域

本發明屬于微生物工程領域，特別涉及一種蛋白核小球藻葉綠素合成缺陷型突變株及其應用。

背景技術

當前國際形勢下，保障糧食安全是關系國民經濟發展、社會穩定和國家自立的全局性重大戰略問題，是建立自主可控、安全的產業鏈基礎。樹立“大食物觀”概念，向植物、動物、微生物要熱量、要蛋白，進一步聚焦新食品原料及新蛋白質和熱量供給，為未來食品提供多元化發展路徑。

目前，經濟作物種植業和畜牧養殖業是食物蛋白質獲取的主要途徑，但存在環境污染嚴重、水土資源消耗大、溫室氣體排放加劇、涉及動物福利等問題，難以滿足人類日益增長的蛋白需求和環境友好型發展方式的要求。在這一大背景下，大規模、低成本、可持續的蛋白質生產方式亟需創新和發展。

蛋白核小球藻是一類單細胞綠藻，蛋白含量高達50％～65％，富含多糖、多不飽和脂肪酸、維生素等多種生物活性物質，具有極高的營養價值，被聯合國世界糧農組織推薦為“二十一世紀最理想食品”。蛋白核小球藻可在人工開放系統或封閉系統中進行光合自養商業化生產，也可在工業發酵系統中實現快速高密度發酵，尤其是發酵法生產潛力巨大，被視作替代蛋白發酵生產的優質微生物種質。

然而，由于野生型小球藻具有刺鼻的藻腥味且呈深墨綠色，導致其食品氣味和感官不佳，成為其作為替代蛋白和食品配料市場應用的最大限制。為解決顏色和氣味干擾，食品級綠藻藻粉的葉綠素脫除加工這一步驟必不可少。單細胞綠藻常用的葉綠素脫除方法包括溶劑提取法和基因改造法。其中溶劑提取法，如超臨界CO₂法、吸附樹脂法和有機溶劑浸提法等工藝復雜，葉綠素和腥味物質的脫除不完全，且會造成高成本、環境污染和營養成分損失。而基因操作、誘變等手段可以實現從根本上抑制或阻斷細胞內葉綠素的生物合成途徑，在遺傳物質水平上突破藻株性狀表達上的瓶頸，可能是更為有效的途徑。

常壓室溫等離子體(atmospheric?pressure?room?temperature?plasma，ARTP)誘變是一種新型的物理誘變育種技術，操作簡易、射流溫度低、活性粒子分布均勻、正向突變率高、對人體和環境無危害，主要應用于真菌、細菌育種，可為選育目的菌株提供創新平臺方法，是降低或消除單細胞綠藻中葉綠素合成與腥味物質形成的新途徑。

然而，人工誘變后會產生大量突變株，突變株的精準快速篩選是獲得優良目標藻株的關鍵環節。目前傳統篩選方法多用搖瓶、平板或試管體系進行培養檢測，多為勞動密集型、操作繁瑣費時、平行度差且效率低下，阻礙了生物誘變育種的進一步發展。因此，建立有效的篩選模型是進行菌種高效篩選的必要條件。其中目標產物合成抑制劑作為定向篩選劑，是篩選高產目標產物菌株常見的手段。通過添加合適劑量的抑制劑，使得一般突變株無法正常合成目標產物甚至死亡，而目標突變株則仍能部分合成目標產物，去除抑制劑后，其目標產物含量往往高于一般突變株。因此，通過選擇合適的致死率，可以大幅度提高篩選效率。此外，高通量篩選技術是一種通量大、特異性高、適用于單細胞微生物的篩選技術。國產全自動高通量微生物液滴培養儀(Microbiol?Microdrop?Culture?system,MMC)成功實現了微生物微液滴培養技術裝備化，可同時對200個獨立的微生物液滴進行微流控系統中的培養，集高通量培養和高精度分選為一體，可進行自動傳代、化學因子梯度添加、液滴在線吸光強度和熒光發射強度檢測等，大幅度提高了篩選效率和精度。

發明內容